半制備規(guī)模單鏈RNA純化

Sean M. McCarthy and Martin Gilar

Waters Corporation, Milford, MA, U.S.

寡核苷酸合成是非常高效和高產(chǎn)率的過程。在固相載體上進(jìn)行寡核苷酸反應(yīng)的典型產(chǎn)率為每耦合階98～99.5%。在典型的多階寡核苷酸合成中，雜質(zhì)聚集在一起，即使是一般大小的21基體寡核苷酸的總產(chǎn)率也達(dá)到67～90%，較長鏈的寡核苷酸的產(chǎn)率相應(yīng)較低。研究人員通常需要使用純度高于初步合成混合物的材料。因此，用于基因敲除、基因分型和診斷目的寡核苷酸通常需要在合成后進(jìn)行純化。適合實驗室規(guī)模寡核苷酸純化的經(jīng)濟可行的解決方案很少，而現(xiàn)有的方法（比如離子交換色譜分析法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法）通常比較繁瑣和費時。在本應(yīng)用說明書中，我們介紹了一種成本低、速度快的中等數(shù)量材料的純化方法，單次進(jìn)樣載量高達(dá)140 nmoles，采用沃特世 ACQUITY UPLC^®系統(tǒng)和寡核苷酸分離技術(shù)（OST）色譜柱化學(xué)技術(shù)可達(dá)到95%以上的最終純度。所提出的純化規(guī)模與標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成規(guī)模匹配良好（50至250 nmol）。下述方法可在15至30分鐘時間內(nèi)完成寡核苷酸純化，得到高純度產(chǎn)品。

 

RNA寡核苷酸5' -CCU UGU AAU CGC UUG ACG ATT -3'由供應(yīng)商處購買，并在110 μL的0.1 M 醋酸三乙胺（TEAA)中進(jìn)行復(fù)溶，得到大約2.8nmol/ μL的溶液。為防止降解，樣品是在使用前不久制備的。

 

RNA寡核苷酸通過沃特世Alliance^® HPLC生物分離系統(tǒng)進(jìn)行純化，使用了沃特世 XBridge™ BEH OST C18 4.6 x 50mm的2.5 μm色譜柱，采用離子對反相色譜法進(jìn)行分離。¹

 

液相色譜系統(tǒng)：沃特世 Alliance HPLC生物分離系統(tǒng)

色譜柱： XBridge OST BEH C18 4.6 x 50mm, 2.5 μm

柱溫： 60 ˚C

流速： 1.0mL/min

流動相A： 0.1M TEAA，pH 7.5

流動相B： 80:20 0.1MTEAA/ACN

梯度： 30 – 52.5% B洗脫10.0分鐘(0.15% ACN／分鐘）

檢測： PDA，260nm

 

分離產(chǎn)物用沃特世 PDA檢測器在260nm處檢測。流動相A由0.1% M醋酸三乙胺（TEAA）組成，流動相B為80:200.1 MTEAA/乙腈。柱溫保持在 60℃。

 

如圖1中所示，盡管寡核苷酸合成的效率很高，在21-基體中仍存在許多失敗序列。

 

盡管色譜柱上超負(fù)荷加載了更大的質(zhì)量負(fù)荷，分離度仍保持N-1, N-2... 雜質(zhì)在主峰前洗脫。對21-基體寡核苷酸主峰從頂點開始進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈�，就會得到極高純度的產(chǎn)物。

 

圖2中所示被選中的餾份收集窗表示不同的質(zhì)量負(fù)荷。峰值采集后，樣品可以根據(jù)需要對等分和干燥，以便長期儲存。TEAA的揮發(fā)性使離子對緩沖組分的去除非常容易。溶劑蒸發(fā)后被純化的寡核苷酸實際上是不含鹽的。

 

純化RNA寡核苷酸的純度通過ACQUITY UPLC系統(tǒng)來驗證。如圖3所示，我們的純化方法有效地減少了失敗序列雜質(zhì)，所產(chǎn)生的寡核苷酸的純度比市面上可以買到的未經(jīng)純化的寡核苷酸高出許多。

 

液相色譜系統(tǒng)： 沃特世 ACQUITY UPLC系統(tǒng)

色譜柱： ACQUITY UPLC OST C18柱，

2.1 x 50mm，1.7 μm

柱溫： 60 ˚C

流速： 0.2 mL/min

流動相A： 0.1M TEAA，pH 7.5

流動相B： 80:20 0.1MTEAA/ACN

梯度： 35 – 85% B洗脫10.0分鐘

(1%ACN／分鐘）

檢測： PDA，260 nm

 

本文介紹的單鏈RNA寡核苷酸的純化策略速度快，成本低，可生成高純度材料。使用OST色譜柱化學(xué)技術(shù)和Alliance HPLC系統(tǒng)，大量的單鏈RNA粗產(chǎn)物可以在短時間內(nèi)成功純化，進(jìn)而得到高純度（約95%）的材料；根據(jù)所收集峰面積與樣品總峰面積的比值進(jìn)行估計，產(chǎn)率可達(dá)55%。

 

該方法對用于RNAi實驗（這類實驗中保證純度和目標(biāo)的特異性至關(guān)重要）的單鏈RNA的純化極為有用。此外，由于T EAA的可揮發(fā)性，該策略可以將純化的寡核苷酸儲存，在沒有T EAA這種不必要的鹽的環(huán)境中，也可以避免其他純化手段中產(chǎn)生的不必要的雜質(zhì)。總的來說，該策略提出了一個比目前可用方法更優(yōu)越的全面純化方法。此外，在考慮樣品純化所需的時間成本、反應(yīng)劑和沃特世XBridge OST色譜的壽命時，這種純化方法非常經(jīng)濟。

 

[1] 寡核苷酸的UPLC分離：方法開發(fā)。沃特世應(yīng)用說明書。2007: 720002383EN。

 

50多年來，沃特世公司(NYSE:WAT)通過提供實用和可持續(xù)的創(chuàng)新，使醫(yī)療服務(wù)、環(huán)境管理、食品安全和全球水質(zhì)監(jiān)測領(lǐng)域有了顯著進(jìn)步，從而為實驗室相關(guān)機構(gòu)創(chuàng)造了業(yè)務(wù)優(yōu)勢。

作為一系列分離科學(xué)、實驗室信息管理、質(zhì)譜分析和熱分析技術(shù)的開創(chuàng)者，沃特世技術(shù)的重大突破和實驗室解決方案為客戶的成功創(chuàng)造了持久的平臺。

2010年沃特世擁有16.4億美元的收入和5,400名員工，它將繼續(xù)帶領(lǐng)全世界的客戶探索科學(xué)并取得卓越成就。