科研中的“新星”技術(shù)——MicroRNA熒光定量PCR

Micro RNA簡(jiǎn)介
微小RNA(microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA)是生物體內(nèi)源長(zhǎng)度約為20－23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA是在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，隨后多個(gè)研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百miRNA。到目前為止，已報(bào)道有幾千種miRNA存在于動(dòng)物、植物、真菌等多細(xì)胞真核生物中，進(jìn)化上高度保守。

Micro RNA產(chǎn)生機(jī)理
miRNA 是轉(zhuǎn)錄后長(zhǎng)片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在細(xì)胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha處理成70-100 個(gè)核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA （ pre-miRNA ）。這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，被另一個(gè)雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 個(gè)核苷酸組成的成熟的 miRNA ，結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（ RISC ）類似或者相同的復(fù)合物中，這個(gè)復(fù)合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對(duì)引導(dǎo) RISC降解目的片段或是阻礙其翻譯過(guò)程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補(bǔ)的堿基配對(duì)決定了這個(gè)過(guò)程的特異性。通過(guò)抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯(cuò)配程度決定的，匹配程度高的目的 mRNA 將被降解。由于 miRNA 可以對(duì)不完全互補(bǔ)的 mRNA 配對(duì)來(lái)抑制蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，因而每個(gè) miRNA 可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè) miRNA可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè) miRNA 來(lái)經(jīng)濟(jì)地調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè) miRNA 的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。對(duì)于基于 miRNA 調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如下圖所示


Micro RNA的特征
已經(jīng)被鑒定的miRNA據(jù)推測(cè)大都是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、約70個(gè)堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羥基，大小約21—25nt的小分子RNA片斷，定位于RNA前體的3’端或者5’端。
最近3個(gè)研究小組分別從線蟲(chóng)、果蠅和Hela細(xì)胞中鑒定的100個(gè)新miRNA中，有15%跨越線蟲(chóng)、果蠅和哺乳動(dòng)物基因組具有高度的保守性（只有有1—2個(gè)堿基的區(qū)別），Lau 和Bartel 實(shí)驗(yàn)室的同事更加認(rèn)為：所有的miRNA可能在其他物種中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個(gè)門(mén)類，這些類似的基因被稱為“直向同源物”）。
Bantam 最早被認(rèn)為是果蠅中參與細(xì)胞增殖的一個(gè)基因位點(diǎn)。已知幾個(gè)包含增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)座子插入跨越這個(gè)位點(diǎn)的一段12.3kb區(qū)域會(huì)導(dǎo)致果蠅的眼和翅重復(fù)生長(zhǎng)，而由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的一段跨越該位點(diǎn)的23kb片斷缺失則導(dǎo)致突變果蠅個(gè)體小于野生型果蠅。Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導(dǎo)入21kb片斷缺失的果蠅中使其恢復(fù)原來(lái)的大小。但是奇怪的是表達(dá)這個(gè)3.85kb片斷中的EST卻沒(méi)有同樣的效果。Cohen將這個(gè)片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)一段90bp的高度保守區(qū)，經(jīng)過(guò)RNA folding program (mfold)發(fā)現(xiàn)這個(gè)保守序列可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得這個(gè)區(qū)段很象是一個(gè)miRNA的前體。這個(gè)結(jié)果經(jīng)過(guò)Northern blot證實(shí)突變果蠅的幼體缺少一個(gè)21bp的bantam miRNA ，用這個(gè)90bp的mRNA前體經(jīng)過(guò)一系列的“功能缺失”—“功能恢復(fù)”實(shí)驗(yàn)，證實(shí) bantam miRNA在細(xì)胞增殖中的作用。研究人員用計(jì)算機(jī)程序檢索在hid mRNA的3’非編碼區(qū)找到了bantam的3個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)（ hid是果蠅中一個(gè)誘導(dǎo)凋亡的基因），并證實(shí) bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉(zhuǎn)錄。
miRNA的表達(dá)方式各不相同。部分線蟲(chóng)和果蠅的miRNA在各個(gè)發(fā)育階段的全部細(xì)胞中都有表達(dá)，而其他的miRNA則依據(jù)某種更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈幌嗪蜁r(shí)相的表達(dá)模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異。

Micro RNA的功能
對(duì)microRNA的研究正在不斷增加，原因是科學(xué)家開(kāi)始認(rèn)識(shí)到這些普遍存在的小分子在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。在線蟲(chóng)，果蠅，小鼠和人等物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的數(shù)百個(gè)miRNA中的多數(shù)具有和其他參與調(diào)控基因表達(dá)的分子一樣的特征——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNA表達(dá)模式具有分化的位相性和時(shí)序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNA有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá)的分子，因而具有重要意義。
第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA——在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，可以通過(guò)部分互補(bǔ)結(jié)合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)(3’UTRs)，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)合成，通過(guò)調(diào)控一組關(guān)鍵mRNA的翻譯從而調(diào)控線蟲(chóng)發(fā)育進(jìn)程(reviewed in Pasquinelli 2002)。
bantam miRNA是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知還有一些miRNA可能參與在細(xì)胞分化和組織發(fā)育過(guò)程中起重要作用的基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，例如mir-14、mir-23 等。
在植物miRNA的研究中有兩條線索提示miRNA可能參與植物的發(fā)育過(guò)程。一是在carpel factory (car) 突變株中3個(gè)miRNA的表達(dá)水平顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個(gè)類似Dicer的酶，參與植物的發(fā)育，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示這種缺陷是由于缺少miRNA加工而造成的。多數(shù)的植物miRNA在某些特定組織中高水平表達(dá)也提示他們可能參與了植物組織的發(fā)育。
對(duì)一部分miRNA的研究分析提示：miRNA參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育(Reinhart 2000)，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代謝（Xu 2003)和細(xì)胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一個(gè)研究表明，2個(gè)miRNA水平的下降和慢性淋巴細(xì)胞白血病之間的顯著相關(guān)，提示miRNA和癌癥之間可能有潛在的關(guān)系(Calin 2002)。
由于miRNA存在的廣泛性和多樣性，提示miRNA可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對(duì)miRNA的研究還處于初級(jí)階段，據(jù)推測(cè)miRNA在高級(jí)真核生物體內(nèi)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。有一種看法是：miRNA可能代表在一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。
然而，大多數(shù)miRNA的功能仍然是個(gè)謎。其機(jī)理和功能見(jiàn)下圖



Micro RNA識(shí)別方法
多個(gè)研究小組采用生物化學(xué)結(jié)合是生物信息學(xué)的方法開(kāi)展對(duì)miRNAs的研究工作。由于據(jù)推測(cè)都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23個(gè)堿基大小、有5’端磷酸基和3’羥基的RNA片斷，有的實(shí)驗(yàn)室采用改良的定向克隆方法來(lái)篩選具有相同特征的小分子——篩選一定大小的RNA分子，連接到3’和5’的適配子（adapters），逆轉(zhuǎn)錄并通過(guò)PCR擴(kuò)增、亞克隆并測(cè)序。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過(guò)向基因組數(shù)據(jù)庫(kù)查詢進(jìn)行。這個(gè)方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產(chǎn)物。
有的實(shí)驗(yàn)室通過(guò)一種RNA folding program ’mfold’ 來(lái)判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區(qū)域是否含有潛在的miRNA前體，然后用Northern Blots的方法來(lái)確定這些miRNA是否真的表達(dá)了。
盡管有數(shù)百個(gè)miRNA通過(guò)生化或者是生物信息學(xué)的方法被鑒別出來(lái)，已經(jīng)鑒別出來(lái)的miRNA只不過(guò)是滄海一粟，由于很多已經(jīng)鑒別出來(lái)的miRNA是從單個(gè)克隆中鑒別出來(lái)的，所以可以假設(shè)還有很多miRNA在分離和鑒定過(guò)程中被“漏掉”了，測(cè)序工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

Micro RNA與干細(xì)胞
近年來(lái)的研究證明，microRNA在干細(xì)胞的自我復(fù)制、定向分化和組織再生中，也起著十分重要的作用。它是干細(xì)胞特性、維持、轉(zhuǎn)化功能的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)者，是當(dāng)前干細(xì)胞調(diào)節(jié)研究的一個(gè)重點(diǎn)。最近，Gangara Ju. VK和Lin H在Nature Stem Cell作了一篇綜述，系統(tǒng)的總結(jié)了microRNA對(duì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。

但是，microRNA對(duì)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于此。它還參與細(xì)胞周期、細(xì)胞重建(Reprograming)、多能干細(xì)胞生成、信號(hào)傳遞、特異分化、Riches、修復(fù)、再生、變異、代謝等所有過(guò)程。

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