自由活動(dòng)大鼠靜脈通路的建立與維護(hù)

摘要: 　
目的　建立可靠的自由活動(dòng)大鼠長(zhǎng)期靜脈輸液通路。方法　在前人的基礎(chǔ)上,對(duì)自由活動(dòng)大鼠靜脈通路的建立進(jìn)行了改進(jìn)和有益的探索。

結(jié)果　70 %的實(shí)驗(yàn)大鼠能順利完成為期一個(gè)月的非連續(xù)輸液實(shí)驗(yàn),手術(shù)死亡率、感染率和管理脫落率較低。結(jié)論　本文所建立的大鼠靜脈輸液通路實(shí)用可靠。

關(guān)鍵詞:大鼠; 自由活動(dòng); 靜脈輸液通路　醫(yī)學(xué)科研活動(dòng)需要各種動(dòng)物模型,很多模型需在動(dòng)物身上建立一條長(zhǎng)期輸液的靜脈通路,并且要求能在動(dòng)物清醒、自由活動(dòng)時(shí)輸液或采血[1 ] 。最常用的動(dòng)物為大鼠,也有猴、豬、兔和小鼠等[2～4 ] 。臨床上體液支持、靜脈營(yíng)養(yǎng)支持、靜脈血壓監(jiān)測(cè)、嚴(yán)重創(chuàng)傷、多臟器功能障礙、物質(zhì)成癮的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均需建立靜脈通路[3 ,5 ,6 ] 。本文在前人的基礎(chǔ)上,介紹一種可靠的、相對(duì)經(jīng)濟(jì)的大鼠靜脈通路建立和維護(hù)的技術(shù)。

　　清潔級(jí)雄性Sprague2Dawley (SD) 大鼠30 只,手術(shù)時(shí)3 月齡,體重250～300 g ,由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

2.1 　插管以及輸液轉(zhuǎn)軸

管道包括靜脈留置聚氨酯管( Polyurethane Intravascular Tubing) BPU-T30 , 內(nèi)徑0.58 mm ,外徑0.91 mm。聚乙烯管BPE-T20 ,內(nèi)徑0.38 mm ,外徑1.09 mm ,這種規(guī)格的聚乙烯管管壁較厚,可抵抗一定強(qiáng)度的外力撕扯。輸液管(COEXTM Tubing , BCOEX-T22 ) , 內(nèi)徑0.61 mm , 外徑1.60 mm。這種輸液管內(nèi)層為聚乙烯PE ,阻力小,液體通過(guò)流暢,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不會(huì)與輸液成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng);外層為聚氯乙烯PVC ,抗撕扯性、耐久性好。整個(gè)輸液系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵設(shè)備即輸液轉(zhuǎn)軸,既要能使液體通過(guò),又要能使大鼠在籠中自由活動(dòng)。輸液轉(zhuǎn)軸很好地解決了這一問題,它使液體通過(guò)的同時(shí)自身能做360 度旋轉(zhuǎn),阻力很小,加一個(gè)力臂,大鼠可輕松地在籠中活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)所用的輸液轉(zhuǎn)軸型號(hào)為375/22 ,如圖1 ,死腔(Dead volume) 為8μL ,摩擦力矩(Frictional torque) 為0.030 盎司2英寸oz-in (約2.160 g/cm) 。

兩端可接輸液管,右下部白色橫桿為力臂,借助彈簧管與大鼠背部相連,注意兩端為表面光滑的管道,沒有螺紋,螺紋應(yīng)為照片不清晰所致。

2.2 　固定和保護(hù)裝置

要防止大鼠撕咬輸液管道,必須要有保護(hù)和固定裝置,輸液轉(zhuǎn)軸到大鼠背部的輸液管道從一根25cm 長(zhǎng)的彈簧管(電爐絲) 中間通過(guò),彈簧管上端連輸液轉(zhuǎn)軸,下端連一個(gè)塑料件。大鼠輸液在其兩前肢上穿上一個(gè)由粘合布做成的馬甲,馬甲背部有一個(gè)塑料件,該塑料件可與彈簧管下端的塑料件對(duì)接,并有一個(gè)扣合裝置。輸液管從彈簧管內(nèi)經(jīng)塑料件到大鼠皮下再到頸外靜脈,整個(gè)輸液管無(wú)外露部分,故能有效防止大鼠撕咬。整個(gè)通路如圖2 所示,但固定帶(Harness) 由自制的馬甲代替。

2.3 　術(shù)前準(zhǔn)備

將BPU 管剪成4 cm 長(zhǎng)小段,BPE 管剪成10 cm長(zhǎng),BPU 管用三氯甲烷泡粗,一端套在BPE 管外面1cm ,組成13 cm 長(zhǎng)管道。在連接部打一圈結(jié),使之成“L”形,由于有一圈結(jié),在“L”的拐角處有一個(gè)小圈。將做好的管子用75 %酒精浸泡消毒,并用生理鹽水沖洗,手術(shù)前用生理鹽水浸泡備用。1 mL 注射器針頭作平頭備用。準(zhǔn)備眼科手術(shù)器材一套,硬膜外穿刺針一根,以便于在鼠背部與頸部打皮下隧道。

3.1 　分離靜脈

大鼠手術(shù)時(shí)體重以250～280 g 為宜,用4 %戊巴比妥鈉50 mgPkg 麻醉,同時(shí)給予阿托品013 mg/kg ,手術(shù)過(guò)程及術(shù)后注意保溫。大鼠背部平肩胛處備皮,剪一小口,約1～2 mm 長(zhǎng),以備插管從背部穿出。翻轉(zhuǎn)大鼠,頭朝術(shù)者,頸部右側(cè)備皮。從下頜至鎖骨上緣縱形剪一小口,約2 cm 長(zhǎng),分離皮下組織,找到右側(cè)頸外靜脈(有的實(shí)驗(yàn)可選用股靜脈[7 ] ) 并分離,滴適量生理鹽水,防水干燥。

3.2 　插管

結(jié)扎靜脈遠(yuǎn)心端,用眼科剪在靜脈上剪一“V”形口,勿剪斷靜脈,先用一小段BPE-T10 管(內(nèi)徑0.28 mm ,外徑0.60 mm) 插入靜脈,因該管很細(xì),插入較容易,再用BPE-T10 將“V”形口挑大一些,“L”形管遠(yuǎn)端連1 mL 注射器,注射器針頭為平頭,插管前端剪成斜面,管內(nèi)注滿生理鹽水。用鑷子夾住BPU-T30 插入“V”形口,插入靜脈3.5～4.0 cm。

3.3 　固定插管

在靜脈上打結(jié)固定插管,因?yàn)檠�管�?nèi)的插管有1 cm 的BPU 管是套在BPE 管外面,而BPE-T20 管壁較厚,故在此段血管上打結(jié)可稍用力,使固定牢固,而不用擔(dān)心管腔會(huì)被扎閉。用手術(shù)縫針在插管小圈內(nèi)連線,將其縫在血管旁邊的肌肉上,線圈要稍寬松,以防肌肉壞死。

314 　打隧道及縫合、穿馬甲

用硬膜外穿刺針從頸部切口到背部小口打皮下隧道,取下1 mL 注射器,插管從隧道穿出大鼠背部,再次連上1 mL 注射器,倒抽回血確認(rèn)插管在血管內(nèi),縫合頸部切口。從插管中打入20 萬(wàn)u 青霉素,用堵頭套在插管末端,給大鼠穿上馬甲;由于麻醉時(shí)大鼠身體較軟,馬甲不可穿是過(guò)緊,以防大鼠窒息。將大鼠放入單養(yǎng)籠,保溫至其蘇醒。

　　手術(shù)后大鼠休養(yǎng)3 d ,每日從靜脈插管注入20萬(wàn)u 青霉素,隨后可每日給予10 萬(wàn)u。給藥同時(shí)即可起到通暢管道作用。肝毒可不作為常規(guī)用藥,如發(fā)現(xiàn)通道壓力增加時(shí)可臨時(shí)給予肝素200～500 u。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠放入輸液籠。自身給藥實(shí)驗(yàn)采用行為操作籠及相應(yīng)的行為軟件控制。將輸液管與注射泵相連,大鼠背部的PE 管與彈簧管內(nèi)的輸液管對(duì)接,輸液完成后可將大鼠從輸液籠中取出,BPE 管末端套上塑料堵頭,放入飼養(yǎng)籠中單養(yǎng)。輸液時(shí)大體如圖3 所示。

因本輸液系統(tǒng)大鼠不輸液時(shí)回到飼養(yǎng)籠,故每次連接管道時(shí)要排盡管管道中的空氣,避免空氣栓塞,并注意無(wú)菌操作。

　　30 只大鼠手術(shù)麻醉時(shí)死亡1 只,術(shù)后次日死亡2 只,余下27 只中途5 只發(fā)生管道堵塞,無(wú)一例感染發(fā)生,共有22 只完成為期1 個(gè)月的自身給藥實(shí)驗(yàn)。

　　發(fā)達(dá)國(guó)家在實(shí)驗(yàn)研究中給小動(dòng)物輸液有40～50 年的歷史[8 ] ,自從輸液轉(zhuǎn)軸由Michael Loughnane(隨后他將其商業(yè)化并成立了INSTECH SOLOMON公司) 于上個(gè)世紀(jì)60 年代發(fā)明之后,眾多的商業(yè)公司相繼開發(fā)了許多給動(dòng)物輸液的配套產(chǎn)品,例如適于各種動(dòng)物的規(guī)格繁多的導(dǎo)管、輸液轉(zhuǎn)軸、固定裝置、注射泵、籠子、軟件等。國(guó)內(nèi)在這方面也有近20 年的歷史,少數(shù)科研單位對(duì)此技術(shù)進(jìn)行了有益的探索,并設(shè)計(jì)了一些價(jià)廉實(shí)用的裝置[6 ,9～11 ] 。

在實(shí)驗(yàn)中給動(dòng)物輸液有幾個(gè)環(huán)節(jié)比較關(guān)鍵,一是輸液管道和輸液轉(zhuǎn)軸,二是插管的固定和連接方法,三是輸液時(shí)對(duì)管道的保護(hù)及減少大鼠自由活動(dòng)的障礙,四是術(shù)后的維護(hù)。從這幾個(gè)方面看,國(guó)內(nèi)報(bào)道的系統(tǒng)有一些問題。比如從注射泵到大鼠靜脈的輸液管道全部采用硅膠管[12 ] ,口徑也不盡相同,有外徑019 mm、112 mm 等。硅膠管能有效減輕排斥反應(yīng),但材質(zhì)柔軟,如全程采用硅膠管,一是插入靜脈后結(jié)扎時(shí)不能扎緊,否則有扎閉管道的危險(xiǎn)[12 ] ,從而管道易脫落;二是管道在輸液時(shí)盡管外面有彈簧管保護(hù),仍有被拉伸擴(kuò)張的可能,造成給藥量不準(zhǔn),這一點(diǎn)對(duì)于自身給藥實(shí)驗(yàn)尤其重要,因?yàn)樽陨斫o藥實(shí)驗(yàn)為非連續(xù)輸液,每一次給藥劑量較小,要求系統(tǒng)能準(zhǔn)確及時(shí)地將微量藥物泵入動(dòng)物體內(nèi);三是全程采用硅膠管者一般管道不會(huì)中斷,大鼠手術(shù)完成后即24 h 呆在輸液籠內(nèi),直至整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。這樣大鼠背帶彈簧管,容易抑制其自主活動(dòng);如果實(shí)驗(yàn)中間更換藥物也極不方便;管道意外破損也難以補(bǔ)救;不給藥時(shí)亦不能進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn),例如行為實(shí)驗(yàn)條件性位置偏愛等[3 ] 。本實(shí)驗(yàn)大鼠體內(nèi)管道采用BPU 管與BPE 管連接,BPU 排斥反應(yīng)與硅膠管相似,BPE 管堅(jiān)固,從而有效解決了上述問題。輸液轉(zhuǎn)軸,這一輸液系統(tǒng)中最有技術(shù)含量的環(huán)節(jié),國(guó)內(nèi)企業(yè)尚無(wú)類似產(chǎn)品出售。許多文獻(xiàn)報(bào)道的輸液系統(tǒng)均采用自行設(shè)計(jì)的類似裝置,比如用活動(dòng)套管和軸承做成注射器樣的結(jié)構(gòu),或頭皮針在橡膠中轉(zhuǎn)動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)輸液時(shí)360 度旋轉(zhuǎn)等[9 ,13 ,14 ] 。這些設(shè)計(jì)難免會(huì)出現(xiàn)漏液、阻力大、死腔大等缺陷,長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)困難較大。插管在大鼠體內(nèi)的固定與插管的關(guān)系前已述及,插管從大鼠背部穿出后,用馬甲固定,插管與大鼠背部垂直,能避免大鼠撕咬。馬甲與彈簧管利用塑料件可方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)接與分離。有的系統(tǒng)將彈簧管末端擴(kuò)成螺圈,將螺圈縫在大鼠背部[10 ,15 ] ,這樣大鼠容易感染,活動(dòng)時(shí)也有疼痛感。彈簧管的長(zhǎng)度與籠子的大小要匹配,以避免彈簧過(guò)松或過(guò)緊。籠子的空間也不能過(guò)大或過(guò)小,本實(shí)驗(yàn)操作籠大小為30 cm ×30 cm ×30 cm。輸液時(shí)裝輸液轉(zhuǎn)軸的吊桿可利用杠桿原理,在支點(diǎn)后裝一合適的負(fù)荷,因大鼠的力臂長(zhǎng),能有效減輕或抵消大鼠活動(dòng)時(shí)背部的負(fù)載。注意雖然輸液轉(zhuǎn)軸可以360度旋轉(zhuǎn),大鼠仍然只能實(shí)現(xiàn)相對(duì)的自由活動(dòng),翻滾旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)則受到限制。大鼠靜脈長(zhǎng)期給藥是一項(xiàng)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)技術(shù),不僅手術(shù)有一定難度,整個(gè)輸液設(shè)備均有特殊要求,每個(gè)細(xì)微的環(huán)節(jié)都可能影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,本文所報(bào)道的方法有一個(gè)明顯的缺點(diǎn),就是大量使用國(guó)外的相關(guān)產(chǎn)品,購(gòu)買不方便,但卻是目前保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的明智選擇。也只有使用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)裝置,才能得到準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,易于被其它的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證,從而獲得同行的公認(rèn)。