用BRET方法研究活細(xì)胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事項
K. M. Kroeger1, K. A. Eidne1, Bernd Hutter2
簡介：
BRET已經(jīng)成功的應(yīng)用于研究哺乳動物細(xì)胞中GPCR同源和異源二聚體以及涉及到受體脫敏作用和交易的受體/β-arrestin相互作用（綜述，1）。BRET的顯著優(yōu)勢是可以在活細(xì)胞中，正確的的位置實時的監(jiān)測蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用。由于GPCR高度的疏水性和細(xì)胞本地化，測量蛋白質(zhì)之間相互作用的常規(guī)技術(shù)（如：免疫共沉淀和酵母2雜交篩選）具有重大的缺陷。BRET是一個簡單的，快速均一法，可以克服這些限制。對7TM受體是一個普遍的過程。這個方法可以作為研究非依賴于他們信號通路的幾乎所有7TM受體的篩選方法。
BRET原理
BRET是一種自然發(fā)生的現(xiàn)象，舉個例子：在水母和海蜇中發(fā)生的水母素和GFP之間發(fā)生的非放射性能量轉(zhuǎn)移。可以通過標(biāo)記了生物發(fā)光供體如：海腎的熒光素酶（Rluc）或者熒光受體如：增強型綠色或者黃色熒光蛋白（EGFP或EYFP）的融合蛋白來研究BRET的相互作用。
當(dāng)相互作用的部分在細(xì)胞內(nèi)共表達，在底物腔腸素存在的情況下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)距離足夠近（在100Å
內(nèi)），將發(fā)生能量從Rluc到EYFP的能量轉(zhuǎn)移，發(fā)出發(fā)射光（2）。依靠于供體和受體分子的嚴(yán)格的距離使BRET成為研究涉及到所有GPCR功能和通過激動劑和拮抗劑的調(diào)節(jié)的受體蛋白相互作用的理想工具。相似的，涉及到熒光供體和受體分子之間的能量轉(zhuǎn)移的FRET技術(shù)，也代表了一種檢測GPCR蛋白相互作用，并且已經(jīng)和成像技術(shù)結(jié)合在空間和時間上檢測GPCR的相互作用的工具。不像FRET,它衍生出來的BRET不需要激發(fā)光，從而避免了自發(fā)熒光，漂白和細(xì)胞的損壞的相關(guān)問題。因此，低背景熒光的BRET技術(shù)在檢測低水平或者較弱的蛋白質(zhì)相互作用時候非常靈敏（3）。FRET代表了一種檢測GPCR蛋白相互作用的，并且已經(jīng)和成像技術(shù)結(jié)合在空間和時間上檢測GPCR的相互作用的工具。通過單細(xì)胞BRET成像來確定蛋白質(zhì)之間相互作用的細(xì)胞定位來顯示在研究蛋白質(zhì)相互作用的中的重大進步。
內(nèi)），將發(fā)生能量從Rluc到EYFP的能量轉(zhuǎn)移，發(fā)出發(fā)射光（2）。依靠于供體和受體分子的嚴(yán)格的距離使BRET成為研究涉及到所有GPCR功能和通過激動劑和拮抗劑的調(diào)節(jié)的受體蛋白相互作用的理想工具。相似的，涉及到熒光供體和受體分子之間的能量轉(zhuǎn)移的FRET技術(shù)，也代表了一種檢測GPCR蛋白相互作用，并且已經(jīng)和成像技術(shù)結(jié)合在空間和時間上檢測GPCR的相互作用的工具。不像FRET,它衍生出來的BRET不需要激發(fā)光，從而避免了自發(fā)熒光，漂白和細(xì)胞的損壞的相關(guān)問題。因此，低背景熒光的BRET技術(shù)在檢測低水平或者較弱的蛋白質(zhì)相互作用時候非常靈敏（3）。FRET代表了一種檢測GPCR蛋白相互作用的，并且已經(jīng)和成像技術(shù)結(jié)合在空間和時間上檢測GPCR的相互作用的工具。通過單細(xì)胞BRET成像來確定蛋白質(zhì)之間相互作用的細(xì)胞定位來顯示在研究蛋白質(zhì)相互作用的中的重大進步。BRET應(yīng)用
為了應(yīng)用BRET技術(shù)來研究受體的相互作用，細(xì)胞中融合蛋白的共表達，如果這兩個融合分子之間的距離足夠近，那么光將從Rluc轉(zhuǎn)移到EYFP.這個激發(fā)光，引起發(fā)射一個波長為530nm的發(fā)射光。BRET被定量為在相同情況下，530nm和480nm的發(fā)光比率。最初BRET是在大腸桿菌中研究光敏生物鐘蛋白的相互作用（2），其他幾個組現(xiàn)在使用BRET技術(shù)來研究哺乳動物細(xì)胞中GPCR蛋白的相互作用，包括受體同源二倍體（4-9）和異源二倍體（10-13）。GPCR和細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用要求也要使用BRET技術(shù)檢測受體功能，如：涉及到受體脫敏作用和內(nèi)在化的受體/β-arrestin的相互作用。因此，理論上，BRET也是研究針對GPCR功能的配體結(jié)合受體信號到脫敏作用，交易的受體相互作用的復(fù)雜實驗的一種強大的工具。
Mithras LB940
Mithras LB940是一款多功能酶標(biāo)儀。獨立光路系統(tǒng)（DOPS-Dedicated Optical Path System）保證了檢測技術(shù)要求的最優(yōu)化表現(xiàn)。他們的功能有發(fā)光，BRET，熒光（頂讀和底讀），光吸收，熒光偏振和AlphaScreen™.另外，提供選配件如：試劑進樣器，溫度控制和冷PMT檢測模塊。
圖2：獨立光路系統(tǒng)和Mithras LB940
方法：
使用BRET方法研究一個潛在的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用涉及到幾個步驟（1）產(chǎn)生兩種感興趣基因的蛋白質(zhì)，他們的一個N和C末端分別和Rluc和EYFP融合。（2）在哺乳動物中共表達兩種BRET融合蛋白。（3）檢測BRET信號。這種方法可以應(yīng)用于研究哺乳動物細(xì)胞中任何蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用。并且對于涉及到GPCRs的相互作用研究頁沒有限制。
BRET融合結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)
構(gòu)成編碼BRET融合蛋白包括以下內(nèi)容：
1. 表達Rluc-EYFP融合蛋白的BRET融合結(jié)構(gòu)的陽性對照（見注2）。
2. BRET結(jié)構(gòu)的陰性對照：如：單獨表達Rluc和EYFP的pRluc, pEYFP，GPCRs對照（非感興趣的GPCR）和其他融合了Rluc或者EYFP的蛋白，（見注3）。在我們的研究中，我們利用促性腺激素釋放激素（GnRH）促甲狀腺激素釋放激素（TRH）和β2腎上腺素受體，他們都是C末端和Rluc和EYFP結(jié)合（見注3）。
3. 首個感興趣的蛋白的BRET供體結(jié)構(gòu)，（C末端（GPCR/Rluc）或者N末端（Rluc/GPCR）標(biāo)記為Rluc的GPCR的表達）（見注4-6）。
4. 第二個感興趣的蛋白的BRET受體結(jié)構(gòu)（C末端（GPCR/EYFP）或者N末端（EYFP/GPCR）標(biāo)記為EYFP的GPCR的表達）（見注4-6）。
BRET融合結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染和共表達
1. 根據(jù)操作說明使用轉(zhuǎn)染試劑來轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞（如：COS-1細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染以前，放置一天使6孔板的每個孔的密度達到2*105個細(xì)胞）（見注7）。
2. 單獨轉(zhuǎn)染帶有GPCR/Rluc融合cDNA細(xì)胞或者共轉(zhuǎn)染帶有GPCR/Rluc和GPCR/EYFP融合的cDNA（見注8）。Rluc 和 Rluc-EYFP BRET對照 cDNA也一同被轉(zhuǎn)染，作為實驗的陽性對照。陰性對照轉(zhuǎn)染也同時進行，包括：其他GPCRs融合到EYFP或者Rluc上顯示非特異性的BRET信號。（見注3 & 8）。
BRET實驗
1. 轉(zhuǎn)然后48小時，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）/0.05%胰蛋白酶分離細(xì)胞。用PBS洗滌兩次，懸浮在500µl的PBS。使用EYFP表達的流式細(xì)胞儀或者LB940多功能酶標(biāo)儀的熒光模塊分析每次轉(zhuǎn)染的大約100000個細(xì)胞。（見注6）..對于BRET，96孔板的每個孔中添加40µl細(xì)胞懸浮液（大約20000個細(xì)胞）
2. 注入10ul腔腸素（新稀釋到25µM）到每個孔中，獲得最終濃度為5uM,并立即使用帶有預(yù)設(shè)為所需溫度（37度）加熱模塊LB940進行讀數(shù)（見注9，10）。
3. 測試在相互作用中的激動劑和拮抗劑（或者其他試劑，化學(xué)/處理）的影響，增強BRET信號，試劑可以在添加腔腸素前預(yù)孵育�；蛘咛砑忧荒c素，控制“未處理”讀數(shù)數(shù)據(jù)，最后通過注射器添加最多三個試劑，隨著時間的推移評估BRET比率的影響。
4. 采用綜合讀數(shù)10秒，收集通過兩個不同波長范圍的的濾光片的光。
圖1：測量BRET信號的讀數(shù)選項。第一個標(biāo)記的發(fā)光為Rluc濾光片選項，第二個標(biāo)記的發(fā)光為EYFP選項。
用兩次測量的結(jié)果根據(jù)下面的公式計算BRET比率。
BRET比率=530nm發(fā)射光/480nm發(fā)射光
5. 然后，數(shù)據(jù)作為一個標(biāo)準(zhǔn)化的BRET比率。定義為，在同一個實驗中，Rluc和EYFP結(jié)構(gòu)共表達的BRET比率比上Rluc結(jié)構(gòu)單獨表達的BRET比率。
說明：
1. 在BRET實驗中使用的腔腸素的形式是非常重要的。幾種不同形式的腔腸素的存在，每種可以導(dǎo)致稍微不同波長光的峰值發(fā)射光。為了能夠發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，供體（Rluc）的發(fā)射光譜需要和能量受體（EYFP）的激發(fā)/吸收光譜顯著重疊。另外，供體和受體的發(fā)射光譜必須能夠足夠的區(qū)分，以允許有最小重疊分子的發(fā)射光能夠分開測量�？紤]到這些因素，使用Rluc和EYFP分別作為供體和受體分子，腔腸素的H形式被使用在BRET實驗中。腔腸素溶解在甲醇中作為儲藏液（500µM）在–20oC下避光保存。僅僅在使用前，腔腸素被BRET試驗緩沖液稀釋到最終濃度為2µM, 用鋁箔包裝，以避光。
2. 為了確認(rèn)BRET信號可以在實驗條件下獲得，應(yīng)該使用BRET陽性對照。通過氨基酸連接器分開直接融合的Rluc和 EYFP蛋白是一個很好的BRET陽性對照。通過克隆沒有它的終止密碼子上游并且添加EYFP編碼序列的螢光素酶編碼區(qū)來準(zhǔn)備。然后添加腔腸素到細(xì)胞中表達Rluc-EYFP融合。Rluc的發(fā)射光直接轉(zhuǎn)移到EYFP,引起了很高的BRET信號，比較從Rluc和 EYFP或單獨的Rluc來獲得BRET比率
3. 當(dāng)檢測受體和受體，或者受體-蛋白質(zhì)相互作用的時候，在BRET實驗中，使用陰性對照是重要的。包括分別標(biāo)記了Rluc或者EYFP和未標(biāo)記EYFP或Rluc受體的表達，來確定BRET信號在相同的細(xì)胞中是否僅僅是由于Rluc和 EYFP的過表達。為了評估受體-蛋白質(zhì)BRET信號的特異性，添加使用其他標(biāo)記的受體的陰性對照，在這些對照中，標(biāo)記受體和感興趣的受體在相似的水平上表達。另外，非標(biāo)記蛋白可以和供體和受體BRET融合共轉(zhuǎn)染，來破壞他們之間的相互作痛從而降低BRET信號。這個方法適合來評估依靠標(biāo)記了Rluc或者EYFP的TRHRs的共表達來獲得的BRET信號的特異性。
4. 為了確定在TRHRs中是否發(fā)生了相互作用（homo- oligomerization），用Rluc或者EYFP來標(biāo)記TRHRs的C末端產(chǎn)生TRHR/Rluc 或者TRHR/EYFP （5）。
5. 沒有BRET信號并不意味著相互作用的缺乏，也可能意味著供體和受體標(biāo)記不在一個有利于能量轉(zhuǎn)移的方向。Rluc或者EYFP融合了N或者C末端標(biāo)記的部分感興趣的蛋白突出的顯示了BRET的重要性。使用這種方法，兩種分別帶有優(yōu)化方向和距離融合分子的供體和受體的伙伴蛋白的相互作用的組合可以給出更靈敏的BRET信號，可以被確定。在感興趣的融合EYFP或Rluc的蛋白質(zhì)之間插入氨基酸連接器序列可能是有用的。當(dāng)執(zhí)行BRET來檢測受體-蛋白之間的相互作用，受體一般標(biāo)記在C末端而不是N末端來增加正確折疊和受體膜定位，減少與配體結(jié)合干擾的機會。
6. 與非標(biāo)記蛋白相比，可以評價BRET融合蛋白的功能，當(dāng)有可能，在使用BRET方法之前。另外，添加Rluc或者EYFP到受體或者感興趣的蛋白可能干擾表達，折疊，定位 或者蛋白質(zhì)功能，在評估潛在受體相互作用的相關(guān)性前，確定標(biāo)記蛋白的功能是否受損是非常重要的。為了評估BRET受體融合結(jié)構(gòu)的功能，需要在receptor/Rluc和receptor/EYFP融合子與非標(biāo)記受體進行比較來進行受體結(jié)合和信號實驗（5）。相互作用的蛋白（β-arrestin）受體的特性將決定采用何種實驗來評估特定感興趣的蛋白的功能是否保留。在β-arrestin作為感興趣的蛋白的情況下。β-arrestin/EYFP或Rluc的融合功能進行評估用1）受體內(nèi)部化試驗來測量促進GPCR內(nèi)部化的能力。2）共聚焦顯微鏡來監(jiān)測β-arrestin/EYFP的配體依賴性易位（5）。在轉(zhuǎn)然后48小時，通過使用Mithras LB940 多功能酶標(biāo)的發(fā)光模塊測量發(fā)光來評估Rluc標(biāo)記蛋白的表達水平，通過使用Mithras LB940 多功能酶標(biāo)的熒光模塊或者帶有熒光活性的流式細(xì)胞儀測量熒光來確定EYFP標(biāo)記蛋白的表達水平。
圖2A：測量Rluc表達的發(fā)光模塊的設(shè)置。雙擊“Read options”對話框下“Measurement”標(biāo)簽左側(cè)的“l(fā)umin label”圖2A：測量Rluc表
圖2B：EYFP表達的熒光模塊的設(shè)置，雙擊“Read options”對話框下“Measurement”標(biāo)簽左側(cè)的“fluor label”
7. 在BRET試驗方案中已經(jīng)使用了COS-1細(xì)胞。然而，可以在任何細(xì)胞類型中進行的BRET也可以進行轉(zhuǎn)染。各種轉(zhuǎn)染試劑和技術(shù)可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)染帶有cDNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。在我們的手中，使用Polyfect 轉(zhuǎn)染試劑（QIAGEN）可以獲得一直的結(jié)果。然而，使用的轉(zhuǎn)染試劑要隨著選擇的細(xì)胞類型而變化。
8. 在進行BRET試驗時，Rluc比EYFP融合蛋白表達的水平重要。不同數(shù)量的Rluc 和 EYFP融合cDNA被傳染和實驗來決定獲得最優(yōu)化BRET信號的條件。融合蛋白的極限表達是不建議的。因為這可能增加非特異性BRET信號，增強陰性對照如：其他的Rluc和EYFP標(biāo)記蛋白和感興趣蛋白在同一水平表達的風(fēng)險。然而，某些相互作用（低親和性相互作用）可能需要較高蛋白表達水平來檢測。除了蛋白質(zhì)表達的cDNA轉(zhuǎn)染總數(shù)，供體對受體蛋白表達的比率也是很重要的，研究每種蛋白質(zhì)相互作用的最優(yōu)化比率需要通過經(jīng)驗來確定。通過滴定的EYFP融合蛋白表達量，同時又保持了Rluc融合表達常數(shù), BRET50（使用熒光計測量EYFP融合蛋白表達，BRET值達到最大值的一半）可以確定為一個相互作用親和力的相關(guān)性的近似措施。GPCRs在異源系統(tǒng)中的過量表達由于這些7TM高度的疏水性可能導(dǎo)致產(chǎn)生不真實的聚集和非特異性的BRET信號（10）。在受體表達的低水平或者在受體的生理水平以下進行BRET,可能有助于防止非特異性BRET信號。但是，蛋白質(zhì)相互作用可能在相對親和力方面各有不同，因此為了檢測相互作用的BRET信號指示要求不同水平的蛋白質(zhì)表達和不同比率的供體的受體分子。
9. 能夠檢測BRET信號儀器的主要特點是具有連續(xù)的濾光片，然后在兩個不同波長范圍進行測量發(fā)射光。目前有幾種多功能酶標(biāo)儀可以做這個實驗，但是由于光學(xué)系統(tǒng)的原因，他們的靈敏度收到很大限制。相反，Mithras是一款多通路光學(xué)系統(tǒng)的多功能酶標(biāo)儀，可以提供測量BRET信號要求的靈敏度（圖2，獨立光路系統(tǒng)）我們和berthold公司在研發(fā)能夠測量高靈敏BRET信號的96孔板多功能酶標(biāo)儀上進行合作。由于遇到上述蛋白質(zhì)極端表達的問題，因此使用低水平的蛋白質(zhì)表達如：接近或者低于生理水平，進行BRET實驗和檢測BRET信號是很重要的。因此，非常期望儀器能有檢測低BRET信號，來降低由于BRET融合蛋白高表達帶來的非特異性BRET信號。
10. 在添加腔腸素到細(xì)胞懸浮液時，由于熒光素酶反應(yīng)顯示快速衰減的動力學(xué)。所以需要立即測量發(fā)射光。最理想的方法是通過儀器帶的試劑注射器來注射腔腸素，
圖3A：選擇底物和處理的進樣器的孔，第四個進樣器允許添加多個期望的處理到不同的孔中
圖4A：在選擇注射孔以后，點擊測量標(biāo)簽，雙擊左邊的“dispense”來設(shè)置屬性
由于BRET信號在添加腔腸后需要幾秒才能達到平衡，采取重復(fù)讀取的所有樣本。并且在添加底物后也要執(zhí)行重復(fù)讀取，隨著時間的推移，可以監(jiān)測相互作用的穩(wěn)定性。在監(jiān)測各種激動劑或者拮抗劑可能對受體-蛋白相互作用的影響的時是特別重要。通過執(zhí)行重復(fù)讀取，一個BRET動力學(xué)分析正在執(zhí)行，可以實現(xiàn)實時的監(jiān)測相互作用。盡管隨著時間的推移，發(fā)射光的實際數(shù)量在減少。陽性對照Rluc-EYFP BRET融合的BRET比率在添加腔腸后保持至少30分鐘恒定，
總結(jié)：
BRET是一種新型的共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，它代表了一個檢測和分析廣泛的蛋白質(zhì)相互作用的有力工具，與目前使用的方法相比具有顯著優(yōu)勢。它代表了強大的，單一性的活細(xì)胞檢測系統(tǒng)，它已經(jīng)成功的應(yīng)用于研究受體的相互作用，也非常適合于研究任何蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用。
材料
· Mithras LB940 多功能酶標(biāo)儀
· PBS Powder 10 x 1L Gibco（Invitrogen）貨號21600-010
· 腔腸（h形式）250ug分子探針貨號 C-6780
· EYFP載體-Clontech公司： pEYFP-C1 貨號 6005-1，pEYFP-N1 貨號6006-1
· Rluc載體-Promega公司：PRL-CMV 貨號 E2261
參考文獻
1. Eidne, K.A., Kroeger, K.M. and Hanyaloglu, A.C. (2002) Applications of novel resonance energy transfer techniques to study dynamic hormone receptor interactions in living cells. Trends. Endocrinol. Metab. 13, 415-421.
2. Xu, Y., Piston D.W. and Johnson C.H. (1999) A bioluminescence resonance energy transfer (BRET) system: application to interacting circadian clock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151-156.
3. Zacharias, D.A., Baird, G.S. and Tsien, R.Y. (2000) Recent advances in technologyfor measuring and manipulating cell signals. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 416-21.
4. Angers, S., Salahpour, A., Joly, E., Hilairet, S., Chelsky, D., Dennis, M. and
Bouvier, M. (2000) Detection of beta 2-adrenergic receptor dimerization in living cell using bioluminescence resonance energy transfer (BRET). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3684-3689.
5. Kroeger, K.M., Hanyaloglu, A.C., Seeber, R.M., Miles, L.E. and Eidne, K.A. (2001) Constitutive and agonist-dependent homo-oligomerization of the thyrotropin-releasing hormone receptor. Detection in living cells using bioluminescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 276, 12736-12743.
6. McVey, M., Ramsay, D., Kellett, E., Rees, S., Wilson, S., Pope, A.J. Milligan, G.(2001) Monitoring receptor oligomerization using time-resolved fluorescence resonance energy transfer and bioluminescence resonance energy transfer. The human delta –opioid Application Note receptor displays constitutive oligomerization at the cell surface, which is not regulated by receptor occupancy. J. Biol. Chem. 276, 14092-14099.
7. Cheng, Z.Y. and Miller, L.J. (2001) Agonist-dependent dissociation of oligomeric complexes of G protein-coupled cholecystokinin receptors demonstrated in living cells using bioluminescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 276, 48040-48047.
8. Ayoub, M.A., Couturier, C., Lucas-Meunier, E., Angers, S., Fossier, P., Bouvier, M.and Jockers, R. (2002) Monitoring of ligand-independent dimerization and ligand-induced conformational changes of melatonin receptors in living cells by bioluminescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 277, 21522-21528.
9. Issafras, H., Angers, S., Bulenger, S., Blanpain, C., Parmentier, M., Labbe-Jullie, C., Bouvier, M. and Marullo, S. (2002) Constitutive agonist-independent CCR5 oligomerization and antibody-mediated clustering occurring at physiological levels of receptors. J. Biol. Chem. 277, 34666-34673.
10. Ramsay, D., Kellett, E., McVey, M., Rees, S. and Milligan, G. (2002) Homo- and hetero-oligomeric interactions between G-protein-coupled receptors in living cells monitored by two variants of bioluminescence resonance energy transfer (BRET): heterooligomers between receptor subtypes form more efficiently than between less closely related sequences. Biochem. J. 365, 429-40.
11. Yoshioka, K., Saitoh, O. and Nakata, H. (2002) Agonist-promoted heteromeric oligomerization between adenosine A(1) and P2Y(1) receptors in living cells. FEBS Lett. 523, 147-151.
12. Lavoie, C., Mercier, J.F., Salahpour, A., Umapathy, D., Breit, A., Villeneuve, L.R., Zhu, W.Z., Xiao, R.P., Lakatta, E.G., Bouvier, M. and Hebert, T.E. (2002) Beta 1/beta 2- adrenergic receptor heterodimerization regulates beta 2-adrenergic receptor internalization and ERK signalling efficacy. J. Biol. Chem. 277, 35402-35410.
13. Hanyaloglu, A.C., Seeber, R.M., Kohout, T.A., Lefkowitz, R.J. and Eidne, K.A. (2002) Homo- and hetero-oligomerization of thyrotropin-releasing hormone (TRH) receptor subtypes. Differential regulation of beta-arrestins 1 and 2. J. Biol. Chem. 277, 50422-50430.
14. Mercier, J.F., Salahpour, A., Angers, S., Breit, A. and Bouvier, M. (2002) Quantitative assessment of beta 1- and beta 2-adrenergic receptor homo- and heterodimerization by bioluminescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 277, 44925-44931.
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com