疾病檢測(cè)新指標(biāo)-miRNA

    microRNA（miRNA）是真核生物中廣泛存在的一種由 non-coding 區(qū)域轉(zhuǎn)錄的小片段 RNA，長(zhǎng)度僅有 19~25 個(gè)核苷酸。根據(jù) miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)，在所有物種發(fā)現(xiàn)的 miRNAs，至今已超過(guò) 2 萬(wàn)個(gè)。miRNA 透過(guò)與標(biāo)的 mRNA 的特異性結(jié)合，經(jīng)由 post-transcriptional 基因沉默的途徑，抑制蛋白質(zhì)生合成。推測(cè)脊椎動(dòng)物的基因組中有超過(guò)1,000 個(gè)不同的 miRNAs，且有將近 1/3 的基因表現(xiàn)受到 miRNA的調(diào)控。

    和 mRNAs 一樣，在不同的組織或發(fā)育時(shí)期，miRNAs 的表現(xiàn)量也會(huì)不同。這些 miRNAs 在細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞的分化以及個(gè)體的發(fā)育等過(guò)程中扮演重要角色。

    在癌癥、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、發(fā)炎反應(yīng)以及自體免疫疾病可觀察到 miRNA 表達(dá)譜的改變。差異表達(dá)的 miRNA 也可能有助于區(qū)分疾病狀態(tài)。miR2Disease 數(shù)據(jù)庫(kù)以人工的方式整理了目前已知與人類疾病相關(guān)的 miRNA 表達(dá)異常（Jiang Q et al., 2009）。分析腫瘤與正常組織，或是不同腫瘤型態(tài)之間  表現(xiàn)的差異，可以找到與癌癥高度相關(guān)的 miRNAs。

miRNA 做為疾病檢測(cè)生物標(biāo)記

       miRNAs 也存在于人類和其他動(dòng)物的血清和血漿中，其種類和數(shù)量可隨著生理狀況或疾病而不同。生化分析顯示，miRNA 可以抵抗血漿和血清中存在的核糖核酸酶、極端的 pH 值和溫度、長(zhǎng)期的儲(chǔ)存以及反復(fù)的結(jié)凍解凍循環(huán)（Mitchell PS et al.,2008）。利用循環(huán)血液中 miRNA 進(jìn)行疾病診斷或預(yù)測(cè)疾病發(fā)生的非侵入式檢測(cè)方式，成為近年來(lái)生物醫(yī)學(xué)家的研究重點(diǎn)。最先將 miRNA 做為血液中生物標(biāo)記的是關(guān)于 B 細(xì)胞淋巴癌（B-cell lymphoma）的研究，在卵巢癌與肺癌病人的周邊血液中也發(fā)現(xiàn)高量的癌癥相關(guān) miRNAs。許多的研究報(bào)告都已說(shuō)明 miRNA 作為腫瘤等疾病診斷與預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記之潛力。

        在2009年，Ji等人發(fā)現(xiàn)，血漿生物標(biāo)記還可以檢測(cè)心臟的損傷。許多報(bào)告指出血漿中 miRNAs與心肌梗塞和心臟衰竭相關(guān)。雖然大多數(shù)關(guān)于疾病的血漿 miRN A檢測(cè)研究使用 real-time PCR，Tijsen 等人用微數(shù)組方法篩選健康對(duì)照者與患有心臟衰竭的患者血漿中的miRNA表達(dá)差異（Tijsen AJ et al., 2010）。他們的研究結(jié)果證明了以微數(shù)組平臺(tái)檢測(cè)血漿中miRNA的變化，做為心臟疾病的生物標(biāo)記的可行性。

miRNA 做為感染早期診斷的指標(biāo)

     細(xì)菌的感染可能會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，如敗血癥（Sepsis）與敗血性休克（Septic shock）。高雄長(zhǎng)庚醫(yī)院楊家森醫(yī)師等人（Hsieh CH et al., 2012）檢測(cè)血液中miRNA的變化，研究在臨床上早期診斷細(xì)菌感染的可行性。將來(lái)自大腸桿菌血清型 026：B6（Escherichia coli serotype 026:B6）、克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa ）、沙門氏菌（Salmonella enterica serotype Enteritidis）以及粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）等革蘭氏陰性菌的lipopolysaccharide（LPS）以腹腔注射的方式注射 4~6 周齡的小鼠，于 2~72 小時(shí)后犧牲小鼠，取得全血與肺臟、腦、肝臟、脾臟。萃取的 RNA 以華聯(lián)小鼠&大鼠 miRNA 芯片（Mouse&Rat miRNA OneArray®）分析 miRNA 的表現(xiàn)，與對(duì)照組（只注射PBS）相比有明顯的不同（圖1）。注射100-μg LPS 6小時(shí)后，在肺組織與全血均有15 種上調(diào)表現(xiàn)差異超過(guò)  2倍的 miRNAs。在大腦中則沒有表現(xiàn)向上調(diào)控的 miRNA 。下調(diào)表現(xiàn)差異超過(guò) 2 倍的 miRNAs 數(shù)目較多，在肺、肝、脾和血液樣本中分別有23, 10, 8, and 51種。大部分在血液中觀察到的向下調(diào)控 miRNAs 并沒有在其他組織中發(fā)現(xiàn)相似的情形。

        以 real-time RT-PCR 驗(yàn)證血液中差異表現(xiàn)超過(guò) 4 倍的 8 種 miRNAs（let-7d, miR-15b, miR-16, miR-25, miR-92a, miR-103, miR-107, and miR-451），在注射100 and 1000-μg大腸桿菌 LPS 6 小時(shí)后，miRNAs表現(xiàn)量增加 5~12 倍（圖2A）。分析不同時(shí)間點(diǎn)的 miRNAs 變化，在注射后  2小時(shí)，miRNAs 表現(xiàn)量就有明顯的增加，并且維持到至少 6 個(gè)小時(shí)；24 小時(shí)只剩 miR-25 和 miR-92a 有顯著的差異表現(xiàn)，72 小時(shí)則與對(duì)照組無(wú)異（圖2B）。

    miRNAs 是免疫反應(yīng)的重要調(diào)控因子，LPS誘導(dǎo)的 Toll-like receptor 4 (TLR4) 訊息傳導(dǎo)（signal transduction）會(huì)活化與 nuclear factor-kappa B (NF-κB) and activator protein 1 (AP-1) 相關(guān)的 pathways，生成許多與發(fā)炎反應(yīng)有關(guān)的 cytokines, chemokines, or leukocyte adhesion molecules。為了了解 TLR4 receptor 在調(diào)控miRNAs 表現(xiàn)中所扮演的角色，在 TLR4 receptor knockout小鼠體內(nèi)注射100-μg LPS后6小時(shí)，let-7d, miR-25, miR-92a, miR-103 and miR-107的表現(xiàn)量明顯比正常C567BL / 6小鼠低（圖3）。

    楊醫(yī)師等人在另一個(gè)研究中，分析小鼠在遭受革蘭氏陽(yáng)性菌感染后，血液中miRNA表達(dá)譜的變化（Hsieh CH et al., 2013）。枯草桿菌（Bacillus_subtilis）、糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等革蘭氏陽(yáng)性菌的 lipoteichoic acid (LTA)，以及不同革蘭氏陰性菌的 lipopolysaccharide (LPS)，腹腔注射6小時(shí)后，以華聯(lián)小鼠&大鼠 miRNA 芯片（Mouse&Rat miRNA OneArray®）分析小鼠全血 miRNA 的表現(xiàn)，叢聚分析結(jié)果如圖4所示。注射枯草桿菌的LTA后，miRNA 的表現(xiàn)明顯與糞鏈球菌/金黃色葡萄球菌的LTA 不同，但是 miR-451, miR-668, miR-1902, and miR-1904 這 4 種 miRNAs 的上調(diào)表現(xiàn)差異均超過(guò) 2 倍。

     以 real-time RT-PCR 驗(yàn)證芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，注射 10-μg LTA 6 小時(shí)后，只有 miR-1902 表現(xiàn)量有顯著的增加，將劑量提高至1000-μg，4 種miRNAs 的表現(xiàn)則增為 3~6 倍（圖5A）。分析不同時(shí)間點(diǎn)的 miRNAs 變化，在注射 100-μg LTA 后 6 小時(shí)，miR-451, miR-1902, and miR-19042表現(xiàn)量有明顯的增加，但是在注射 24 小時(shí)后，只剩 miR-451 有顯著的差異表現(xiàn)；2 小時(shí)與 72 小時(shí)則與對(duì)照組無(wú)異（圖5B）。

        血清中 miRNA 的變化與全血中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，除了在注射 10-μg LTA 6 小時(shí)后，miR-1904表現(xiàn)量也有顯著的增加（圖6A）；此外，注射100 μg LTA 后 2 小時(shí)就可以觀察到 miR-1902 and miR-1904 表現(xiàn)量的增加，注射 24 小時(shí)后，只剩 miR-1902 有顯著的差異表現(xiàn)（圖6B）。白血球中的 miRNA 表現(xiàn)則沒有任何改變（圖7A）。

        TLR2 receptor knockout 小鼠在接受 LTA 注射后，miR-451, miR-668, miR-1902, and miR-1904 的表現(xiàn)則增為 6~10 倍（圖7B），甚至比正常 C567BL / 6 小鼠還高（圖7B）。

小結(jié)

    由上述兩篇研究報(bào)告的結(jié)果，證明了小鼠遭受革蘭氏陽(yáng)性菌或陰性菌感染后，血液中miRNAs的表現(xiàn)有明顯的差異，或許可做為細(xì)菌感染的早期診斷生物標(biāo)記。

       miRNAs 的發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)于基因表現(xiàn)的調(diào)控系統(tǒng)有了新的思維，并幫助我們找到許多疾病的病因。一個(gè) miRNA 分子可以同時(shí)調(diào)控?cái)?shù)十個(gè)以上的基因表現(xiàn)，找尋到數(shù)個(gè) miRNA 分子的表現(xiàn)變化，就可以為研究帶來(lái)許多新的視野與方向。利用miRNA microarray 分析 miRNA 表達(dá)譜，可快速篩選出許多具有表現(xiàn)差異的 miRNAs ，是研究miRNA 在疾病中所扮演的角色的第一步。再針對(duì)個(gè)別 miRNA 的深入研究，將有助于了解致病機(jī)制，開發(fā)新的臨床診斷工具甚至是新的治療方法。

參考文獻(xiàn)

(1) Hsieh CH et al. Whole blood-derived microRNA signatures in mice exposed to lipopolysaccharides. J Biomed Sci. (2012) 19(1): 69

(2) Hsieh CH et al. Circulating microRNA signatures in mice exposed to lipoteichoic acid. J Biomed Sci. (2012) 20(2)

(3) Jiang Q et al. miR2Disease: a manually curated database for microRNA deregulation in human disease. Nucleic Acids Research(2009) Jan; 37 (Database issue): D98–104.

(4) Tijsen AJ et al. MiR423-5p as a circulating biomarker for heart failure. Circ Res. (2010) Apr; 106(6): 1035-1039.