使用超高效合相色譜(UPC²)分析人體尿液中的三環(huán)類抗抑郁藥

圖1. 三環(huán)類抗抑郁藥分析物的結(jié)構(gòu)式。

實驗

樣品描述

采用Oasis WCX 96孔 µElution板制備尿樣。首先，在200 µL樣品中加入200 µL的4% H₃PO₄溶液，混勻；先用200 µL甲醇平衡萃取板中的各孔，然后用200 µL水平衡；將樣品稀釋液(400 µL)加載到板上；依次用200 µL 10 mM醋酸銨溶液(pH 6)、200 µL甲醇淋洗；用含2%甲酸的ACN/MeOH(60:40)溶液洗脫TCA，每次25 µL，洗脫2次，合并洗脫液。取洗脫液2 µL直接注入ACQUITY UPC²系統(tǒng)。

儲備溶液和工作溶液均以甲醇為溶劑。向2 mL尿液中加入20 µL復(fù)合工作溶液（各化合物濃度為1 µg/mL）制成含5種抗抑郁藥的尿樣，此方法制成的尿樣濃度為10 ng/mL。其它濃度的樣品溶液通過使用對照人體尿液連續(xù)稀釋高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備而得。在本論證性研究中，制備并用于萃取的尿樣最終濃度分別為：0.1、0.2、0.5、1.0、5.0和10.0 ng/mL。為確定定量下限(LLOQ)，實驗還對空白尿進行了萃取。

表1. 4種抗抑郁藥物組的MS條件。

結(jié)果與討論

之前已證明混合模式SPE是生物分析中最常選擇的一類樣品制備方法，這依賴于其分離分析物與內(nèi)源性干擾物的雙正交保留機制。因此，混合模式SPE是本次實驗的首選。選用混合模式的弱陽離子交換劑基于以下兩個方面的原因：分析物呈堿性，需要通過離子交換保留；此特定吸附劑的最終洗脫液實際呈酸性。進樣溶劑的篩選結(jié)果表明，采用酸性進樣溶劑可獲得最佳的峰型和靈敏度（此處不作數(shù)據(jù)說明）。因此，Oasis WCX是不二之選。對通用的提取方法稍作修改，確保所有分析物通過離子交換可完全保留。人體尿液經(jīng)SPE處理后，最終洗脫液中所有分析物的回收率為92%至104%，RSD為3%至6%。SPE洗脫液可直接進樣，不需做進一步的稀釋或蒸發(fā)，從而簡化了整個工作流程，提高了分析通量。

系統(tǒng)性色譜篩選

方法開發(fā)過程對色譜柱、改性劑和改性添加劑進行了系統(tǒng)篩選，以獲得最佳分離結(jié)果。經(jīng)篩選的4種UPC²色譜柱如下：ACQUITY UPC² BEH、BEH 2-EP、HSS C₁₈ SB和 CSH™ Fluoro-Phenyl，所有色譜柱規(guī)格均為2.1×50 mm，填料粒徑為1.7 µm。3種流動相B溶劑分別為甲醇、含0.2%甲酸的甲醇和含0.2% NH₄OH的甲醇。篩選過程采用流動相B在3 min內(nèi)從2%增加至45%，達到45%時保持1.5 min的常用梯度。當(dāng)以添加有氫氧化銨的甲醇作流動相時，各色譜柱分析所得的峰形、靈敏度和分離度均為最佳。四種固定相使用此高pH流動相所得分析結(jié)果的對比情況如圖2所示。除HSS SB色譜柱外，其它色譜柱的出峰順序相似。但是，由HSS SB色譜柱得出的譜峰明顯更寬，這將導(dǎo)致信噪比降低并影響低濃度樣品的檢測。峰變寬可能是由于分析物與固定相之間的次級相互作用所致。采用ACQUITY UPC²系統(tǒng)分析其它類化合物（本文未涉及此部分實驗內(nèi)容）時發(fā)現(xiàn)：使用具有緩沖作用的流動相改性劑（如，20至40 mM的甲酸銨）可以改善峰形。在本文的研究中，色譜分析的主要目標(biāo)不是使分析物達到絕對的基線分離，而是獲得最佳的峰形和最高靈敏度，因此我們對各色譜柱所得的峰面積進行了測定。在高pH改性劑條件下，使用各色譜柱得出的分析物峰面積如表2所示。

圖2：以含0.2% NH₄OH的甲醇為流動相B時，不同固定相的分析結(jié)果。

表2. 使用4種不同色譜柱所得的峰面積概覽表。

在不同色譜柱的篩選實驗中，阿米替林和丙咪嗪的峰面積無顯著變化，但地昔帕明和去甲替林受固定相化學(xué)性質(zhì)的影響，峰面積發(fā)生了明顯改變。例如，地昔帕明在使用BEH色譜柱分析時所得峰面積較其它色譜柱增大了11%至40%。同樣，去甲替林的峰面積在BEH色譜柱分析條件下較其它色譜柱增大了21%至40%。雖然BEH 2-EP色譜柱的總體分離效果較其它色譜柱稍有改善，但采用BEH色譜柱時信號強度更高。因此BEH色譜柱是進行TCA低濃度水平定量分析的最佳選擇。此外，BEH色譜柱所得色譜峰的平均基線峰寬＜2 s，提高了低濃度樣品測定的信噪比。

運用各個色譜柱進行試驗時觀測到系統(tǒng)最大壓力低于4200 psi，系統(tǒng)在此低于壓力限值的條件下運行良好，可以靈活地根據(jù)需要提高流速，進一步縮短運行時間。

除對固定相進行了篩選外，本實驗還對不同的改性劑進行了評估。圖3所示為不同流動相B改性劑對ACQUITY UPC² BEH色譜柱的影響，其它色譜柱受影響的趨勢與此相似。使用NH₄OH作為改性劑時常可獲得最佳的分離度和峰形。單獨用甲醇作流動相時，所得譜峰最寬，洗脫時間最遲，分離度最差。選擇甲酸作為改性劑時，所得分析結(jié)果比使用NH₄OH所得結(jié)果的保留時間增大，分離度降低且譜峰更寬。

為縮短運行時間并提高樣品分析通量，本實驗對篩選梯度進行了“壓縮”。結(jié)果表明，梯度壓縮后所得峰形、分離度和靈敏度均未受負面影響。最終的整個運行時間確定為3 min。

圖3：使用BEH色譜柱時，流動相B中加入不同改性劑后所得分析結(jié)果。

靈敏度、線性和定量準(zhǔn)確度

本實驗還通過少量的研究對方法的準(zhǔn)確度和線性進行了評估。使用濃度范圍為0.1-10.0 ng/mL的對照人體尿液制備簡化標(biāo)準(zhǔn)曲線（無內(nèi)標(biāo)物）。采用“實驗”部分最后確定的分析條件進行測定，按照1/x的加權(quán)系數(shù)計算所得的曲線呈線性，R2＞0.998，各標(biāo)準(zhǔn)曲線點理論濃度的平均偏差<8%。表3所示為阿米替林的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線統(tǒng)計數(shù)據(jù)。對于所有分析物，0.1 ng/mL的LLOQ均可輕松實現(xiàn)。此濃度下，阿米替林、丙咪嗪、去甲替林和地昔帕明-D3的信噪比依次為334:1、292:1、590:1和66:1。各組分的信號強度是空白尿樣提取物信號的5倍，符合FDA的LLOQ測定標(biāo)準(zhǔn)。圖4所示為0.1 ng/mL地昔帕明-D3和空白尿液的典型提取離子色譜圖。

圖4. 空白尿液提取物(下方色譜圖)和含0.1 ng/mL地昔帕明-D3的尿液提取物(上方色譜圖)。

表3. 阿米替林(從人體尿液中提取)的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

結(jié)論

UPC²技術(shù)成功應(yīng)用于人體尿液中TCA的分析和定量。主要參數(shù)的自動篩選功能為本研究組中的4種TCA提供了極好的分離度和譜峰強度。對篩選出的梯度條件略作調(diào)整后，最終的總運行時間為3 min，尿液樣品由Oasis WCX 96孔µElution板進行提取處理。人體尿液中提取TCA的回收率范圍為92%至104%。簡化標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的濃度范圍為0.1-10.0 ng/mL，曲線上各點呈線性分布，平均準(zhǔn)確度為99%。各分析物的LLOQ均可達到0.1ng/mL，足以滿足生物分析的要求。

總的來說，本應(yīng)用紀要展現(xiàn)了UPC²這種新型分離技術(shù)在生物分析這一重要應(yīng)用領(lǐng)域中的實用性和應(yīng)用優(yōu)勢。UPC²技術(shù)使用綠色環(huán)保的CO₂作為主要流動相、樣品無需稀釋或濃縮即可直接進樣，另具公認的正交性（對反相色譜而言），使其在生物基質(zhì)中藥物的分析定量方面?zhèn)涫芮嗖A。