側(cè)腦室注射1922IgG2saporin致癡呆動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究

摘 要

建立老年性癡呆模型大鼠,并觀察其學(xué)習(xí)記憶能力及基底前腦膽堿能神經(jīng)元數(shù)目的變化。在成年SD大鼠左側(cè)側(cè)腦室注射免疫毒素1922IgG2saporin(2. 5μg/5μl) , 3周后行Y迷宮檢測其學(xué)習(xí)和記憶能力; 4周后處死大鼠,采用免疫組化結(jié)合圖像分析技術(shù)觀察各組大鼠基底前腦ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)目的變化。結(jié)果顯示:模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與正常組相比明顯下降(P<0. 01);模型組基底前腦的內(nèi)側(cè)隔核(MS)和斜角帶垂直部(VDB)膽堿能神經(jīng)元數(shù)目分別減少至正常組的9. 70%和14.09%,與正常組相比均明顯下降(P<0. 01);學(xué)習(xí)、記憶能力與基底前腦膽堿能神經(jīng)元數(shù)目密切相關(guān)。上述結(jié)果表明應(yīng)用1922IgG2saporin免疫毒素能成功建立AD大鼠動(dòng)物模型,該模型可用于抗癡呆藥物的篩選及藥效的評(píng)價(jià)。Alzheimer病(AD)的主要癥狀是進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和學(xué)習(xí)記憶能力損害,其發(fā)病率隨年齡的增大而增高。迄今為止,由于AD的發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜,故在臨床上缺乏有效的治療措施。建立一個(gè)可靠的AD動(dòng)物模型是研究AD的重要環(huán)節(jié),近年來國內(nèi)外學(xué)者為探討AD的發(fā)病機(jī)理和開發(fā)有效的治療藥物,曾建立了一些AD模型,但目前還沒有一個(gè)理想的模型能夠再現(xiàn)該病的所有特征。腦內(nèi)乙酰膽堿(ACh)能神經(jīng)系統(tǒng)的退行性變被認(rèn)為是造成AD的主要病理因素之一,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用具有選擇性免疫毒素1922IgG2saporin[124]在成年SD大鼠一側(cè)側(cè)腦室注射來建立AD動(dòng)物模型,并觀察其學(xué)習(xí)記憶能力及基底前腦膽堿能神經(jīng)元的變化。

 

材料與方法

 

1.  材料

乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)單克隆抗體購自Chemicon公司, Ultrasensitive SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均為MaxinBiotech Inc. 公司產(chǎn)品。成年雄性Sprague2Dawley(SD)大鼠24只,體重250～300g,隨機(jī)分為: (1)正常組(n=8); (2)生理鹽水組(n =8):左側(cè)側(cè)腦室注射生理鹽水溶液5 μl; (3)模型組(n=8):左側(cè)側(cè)腦室注射1922IgG2sa2porin溶液2. 5μg/ 5μl。

 

2.動(dòng)物模型制作

模型組大鼠用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)行腹腔注射,動(dòng)物麻醉后采用平頭顱位固定于立體定位儀上。全部器械以1%新潔而滅溶液浸泡過夜(加1%亞硝酸鈉防銹)。依次用3%碘酒、75%酒精消毒。沿顱頂正中矢狀位切開頭皮,刮除骨膜,用3%H2O2 燒灼。使顱骨發(fā)白,用消毒棉簽充分推開傷口,參照大鼠立體定位圖譜,以前囟為零點(diǎn),按前囟后0. 8mm,外側(cè)1. 5mm坐標(biāo)用7號(hào)針頭把顱骨鉆一孔,用10μl微量進(jìn)樣器取1922IgG2saporin 2. 5 μg / 5 μl,從該孔垂直進(jìn)針,針深至腹側(cè)5. 5mm,緩慢勻速推注,時(shí)間不少于5min,再留針3min。傷口消毒,縫合皮膚。生理鹽水組用同樣的方法注射5μl的生理鹽水。飼養(yǎng)3周后,進(jìn)行Y迷宮行為檢測。4周后處死大鼠,采用免疫組化結(jié)合圖像分析技術(shù)觀察各組大鼠基底前腦ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)目的變化。

 

3.  Y迷宮行為檢測

3周后,各組大鼠在三等份輻射式迷宮箱中進(jìn)行檢測,箱的每支臂頂端裝有信號(hào)燈,燈亮區(qū)為安全區(qū),安全區(qū)的方位隨機(jī)變換。選用電壓70V電擊延時(shí)30s。訓(xùn)練大鼠學(xué)會(huì)分辨安全信號(hào)燈而主動(dòng)逃避電擊。在條件性回避反應(yīng)建立后,每天分上、下午各給大鼠10次測試,連續(xù)訓(xùn)練6d,其間10次測試中有9次以上正確為學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。記錄每只大鼠達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練次數(shù)為學(xué)習(xí)能力(次數(shù)越少,表示學(xué)習(xí)能力越強(qiáng),反之越弱);到達(dá)學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)24h后再進(jìn)行一輪測試,正確次數(shù)為記憶能力(次數(shù)多,表示記憶力強(qiáng),反之弱)。

 

4.  組織切片制作及染色

麻醉動(dòng)物,經(jīng)左心室2升主動(dòng)脈快速連續(xù)灌注200ml生理鹽水,至肝臟顏色變白后再灌注4%多聚甲醛溶液250ml(0. 1mol/LPB配制, pH7. 4),按先快后慢的原則, 60min內(nèi)灌注完畢。迅速開顱取腦,置于4℃的同樣固定液中后固定約2～4h,然后將腦組織移入15%的蔗糖溶液(0. 1mol/LPB配制, pH7. 4)中置4℃冰箱過夜,再入30%蔗糖溶液(0. 1mol/LPB配制, pH7. 4)4℃過夜。腦組織用恒冷箱切片機(jī)作冠狀連續(xù)切片,片厚40μm,用PBS收集切片。切片始于胼胝體交叉的起始水平,止于前連合交叉前緣,每隔3片取2片,按ABC法進(jìn)行免疫組化染色。切片首先用0. 01mol/L的PBS(pH7. 2)洗5min×3次;每張切片加一滴過氧化物酶阻斷劑處理30min, PBS洗5min×3次;進(jìn)而加一滴正常非免疫動(dòng)物血清處理30min;吸干試劑后,每張切片再加50μl ChAT單克隆抗體溶液(1∶800),于4℃冰箱孵育過夜。此日用PBS洗5min×3次;依據(jù)上述方法,按順序分別加生物素標(biāo)記的二抗和鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶,最后每張切片加新鮮配制的DAB顯色液(850ml雙蒸水加DAB試劑盒A、B、C各1滴)50μl顯色3～6min,鏡下觀察顯色滿意以后用PBS漂洗,貼片,涼干后梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

 

5.  電腦采圖及計(jì)數(shù)

每只大鼠選取隔2斜角帶復(fù)合體5個(gè)代表平面,每個(gè)平面在低倍鏡(4 ×)下選擇一側(cè)內(nèi)側(cè)隔核

(MS)和斜角帶垂直部(VDB)觀察視野,再于中倍鏡(20×)下以2個(gè)視野包括MS和VDB細(xì)胞密集區(qū),使用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(德國KONTRONIBAS2. 0,JVCky2F30B32CCD彩色圖像攝錄輸入儀)顯示視野,通過圖像分析處理,對(duì)陽性神經(jīng)元的數(shù)目、面積和周長進(jìn)行定量檢測;高倍鏡下(40×)觀察神經(jīng)元形態(tài)。

 

6.  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(�x±s)表示。用SPSS11. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組資料的比較采用t檢驗(yàn),兩變量的相關(guān)性采用直線相關(guān)回歸分析。

 

結(jié)  果

1.  各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較Y迷宮檢測各組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的結(jié)果見表.經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)顯示:模型組大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力明顯下降,與正常組和生理鹽水組比較均有顯

著性差異(P<0. 01)。