大鼠短暫腦缺血術(shù)后行為學(xué)的評(píng)價(jià)

摘  要: 目的  觀察大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO) 2 h造成的短暫腦缺血大鼠(MCAO大鼠)行為學(xué)表現(xiàn)。方法  采用插線法阻塞成年SD大鼠大腦中動(dòng)脈制作短暫腦缺血模型,分別對(duì)模型大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)、四肢協(xié)調(diào)性及學(xué)習(xí)記憶能力檢查;術(shù)后第14天處死大鼠取腦組織進(jìn)行四氮唑紅(T TC)染色鑒定模型的成功與否。對(duì)照組不進(jìn)行動(dòng)脈阻塞。結(jié)果  術(shù)后1 h至第14天, MCAO 大鼠與對(duì)照組比較,在神經(jīng)行為學(xué)、協(xié)調(diào)性及學(xué)習(xí)記憶能力等方面均有明顯的缺失和障礙( P< 0101) 。結(jié)論  采用插線法制作的大鼠短暫腦缺血模型操作簡(jiǎn)單;術(shù)后動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)是1種半定量分析,具有敏感、客觀的特點(diǎn),能夠廣泛應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)研究。

 

關(guān)鍵詞: 大腦中動(dòng)脈阻塞; 短暫腦缺血; 行為學(xué); Y迷宮實(shí)驗(yàn)

 

缺血性腦血管病約占所有腦血管病的70 % ,與其他腦血管病相比,具有“三高一低”的特點(diǎn),即高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率、低死亡率。我國(guó)每年新發(fā)病人數(shù)120萬(wàn)～150萬(wàn),幾乎所有的病例均遺留不同程度的殘疾。從經(jīng)濟(jì)學(xué)、社會(huì)學(xué)角度考慮,缺血性腦血管病對(duì)人類的威脅較其他類型的腦血管病更大。因此,對(duì)缺血性腦血管病而言,迫切需要尋找合理有效的治療措施。目前,對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究多數(shù)來(lái)源于廣泛或局部腦缺血的動(dòng)物模型,此模型的病理改變同人類的腦中風(fēng)相類似,是一種較為成熟的動(dòng)物模型,被廣泛應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)研究中。通過對(duì)大腦中動(dòng)脈的有效阻塞后的再灌注,使腦中特定部位發(fā)生壞死和凋亡。

 

本實(shí)驗(yàn)試圖通過建立缺血2 h的大鼠短暫腦缺血模型,從大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)和學(xué)習(xí)記憶能力兩方面對(duì)該模型作出評(píng)價(jià),從而為進(jìn)一步的治療效果提供合理的評(píng)價(jià)依據(jù)。

 

111 材料

雌性SD大鼠24只,體質(zhì)量250～300g ,由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為2組: MCAO 大鼠12只,對(duì)照組12只。對(duì)照組只做手術(shù)但不插線栓塞血管。112 制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠用10 %水合氯醛麻醉(013 ml/ 100g) ,仰臥位取頸部正中切口,暴露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈 、頸外動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈 。距頸總動(dòng)脈分叉部10 mm處將頸外動(dòng)脈用3 - 0絲線結(jié)扎;用3個(gè)動(dòng)脈夾分別夾閉頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈。用1 ml注射器在頸外動(dòng)脈上刺1個(gè)小孔(在頸外動(dòng)脈結(jié)扎處至頸總動(dòng)脈分叉部之間) ,用30 mm長(zhǎng)、4 - 0尼龍線(尖端燒成圓形,以免刺破血管內(nèi)壁)經(jīng)此小孔插入,松開頸內(nèi)動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾,將插線經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉處插入頸內(nèi)動(dòng)脈直至堵塞住大腦中動(dòng)脈(從頸總動(dòng)脈分叉處插入線長(zhǎng)18～20 mm) 。90 min后,拔出插線。近心端結(jié)扎頸外動(dòng)脈,松開頸總動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾,肉眼可見血管內(nèi)血流恢復(fù)。分層縫合手術(shù)切口,注意動(dòng)物保暖。

 

113 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

11311 神經(jīng)行為學(xué)檢查:神經(jīng)學(xué)缺失于大鼠缺血和再灌注后不同的時(shí)間段進(jìn)行。具體時(shí)間為缺血后再灌注6 h , 1、2、3、7、10、14 d。2組大鼠隨機(jī)取6只,神經(jīng)學(xué)檢查標(biāo)準(zhǔn)按照Lo nga等提出的進(jìn)行評(píng)分: 0 分為正常; 1 分為栓塞動(dòng)脈對(duì)側(cè)上肢不能完全伸展,而同側(cè)上肢正常; 2 分為栓塞動(dòng)脈對(duì)側(cè)上肢屈曲,向?qū)��?cè)推時(shí)抵抗力下降,沒有旋轉(zhuǎn); 3 分為栓塞動(dòng)脈對(duì)側(cè)上肢屈曲,向?qū)��?cè)推時(shí)抵抗力下降,行走時(shí)向?qū)��?cè)有輕度旋轉(zhuǎn); 4 分表現(xiàn)為行走時(shí)向?qū)��?cè)有嚴(yán)重旋轉(zhuǎn); 5 分為大鼠身體倒向梗死對(duì)側(cè)。

 

11312 攀繩實(shí)驗(yàn):本實(shí)驗(yàn)主要檢查大鼠雙前肢和雙后肢的協(xié)調(diào)配合能力。實(shí)驗(yàn)于手術(shù)后2、3、7、10、14 d后進(jìn)行。為完成實(shí)驗(yàn),大鼠需要具有運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)的能力。取直徑115 cm的麻繩從高1 m、長(zhǎng)和寬分別為1 5、5 0 cm的平臺(tái)上垂下,手術(shù)前1 d訓(xùn)練每只大鼠,使之能夠爬到繩子的上1/ 3。

 

從術(shù)后第2天開始,每個(gè)測(cè)試日測(cè)試3次。評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)如下: 0 分,不需任何刺激在10 s內(nèi)爬上平臺(tái); 1 分,不需任何刺激在15 s內(nèi)爬上平臺(tái); 2分,刺激次數(shù)小于5次,在30 s內(nèi)爬上平臺(tái); 3分,刺激次數(shù)小于5次,在60 s內(nèi)爬上平臺(tái); 4分,刺激次數(shù)大于5次,在60 s內(nèi)爬上平臺(tái)或是刺激小于5次,但爬上平臺(tái)時(shí)間超過60 s ; 5分,大鼠不能爬上平臺(tái)。

 

11313 Y迷宮學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練及測(cè)試:動(dòng)物分為3組, A、B 2組隨機(jī)取3只大鼠,另取3只同樣規(guī)格的正常大鼠作為對(duì)照。分別于手術(shù)后第3、4、1 4天 進(jìn) 行 試 驗(yàn) 。Y型 電 迷 宮 臂 長(zhǎng)3 0 cm ,高1 5 cm ,寬1 5 cm。每臂末端有1 5 W信號(hào)燈示安全區(qū),箱底銅柵間隔4 mm。電流強(qiáng)度017 mA ,選用電壓38 V ,電擊延時(shí)2 s。設(shè)一臂為起步區(qū),按 Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ臂順序輪流作為安全區(qū)。大鼠在起步區(qū)靜置3 min ,予以電擊致其逃至安全區(qū),燈光持續(xù)15 s ,然后熄燈休息45 s ,開始下一次操作。學(xué)習(xí)訓(xùn)練及測(cè)試:規(guī)定大鼠受電擊后從起步區(qū)直接逃至安全區(qū)為“正確反應(yīng)”,以達(dá)到連續(xù)10次電擊均為正確反應(yīng)(即10/ 10)前所需的電擊次數(shù)(即嘗試次數(shù))表示其學(xué)習(xí)獲得能力(acquisi2tio n)。若嘗試次數(shù)超過30次則不再測(cè)試,并以30次為最大值計(jì)數(shù)。記憶再現(xiàn)(ret rieval)測(cè)試:選上述達(dá)到10/ 10標(biāo)準(zhǔn)的大鼠,休息24 h后再次同法測(cè)試,以達(dá)10/10標(biāo)準(zhǔn)前的嘗試次數(shù)表示記憶再現(xiàn)能力。

 

114 TTC染色

大鼠MCAO手術(shù)第14天, A、B組分別隨機(jī)取6只動(dòng)物,用水合氯醛過量麻醉處死(500 mg/ k腹腔注射) ,經(jīng)心臟灌注生理鹽水。在大腦耳間線前1 2 mm(為 額 葉 皮 質(zhì) 的 感 覺 和 運(yùn) 動(dòng) 區(qū)) 至510 mm(為海馬中部)處切成腦片,片厚1 mm ,然后將腦片放入4 %四氮唑紅(2 , 3 , 5Ot rip henyltet razoliumchloride , T TC)磷酸鹽緩沖液中,3 7 ℃避光孵育30 min ,取出置于10 %多聚甲醛液中固定,拍照。

 

 

211 鼠術(shù)后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分術(shù)后1h至第14天MCAO組大鼠和對(duì)照組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)相比較, 對(duì)照組明顯好于MCAO組 。2者 在 多 個(gè) 時(shí) 間 段 都 有 顯 著 差 異( P< 0101) , 隨著術(shù)后時(shí)間的推移,手術(shù)組大鼠的癥狀有所改善,但評(píng)分始終在2分以上,明顯存在不可逆的神經(jīng)行為學(xué)損傷212 攀繩實(shí)驗(yàn)結(jié)果術(shù)后第2～14天MCAO組大鼠和對(duì)照組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)相比較,對(duì)照組明顯好于MCAO組。2者在多個(gè)時(shí)間段都有顯著行差異( P <0101) , 隨著術(shù)后時(shí)間的推移, MCAO 組大鼠的癥狀有所改善,但評(píng)分始終在3分以上,明顯存在不可逆的神經(jīng)行為學(xué)損傷(圖2) 。

 

213 Y迷宮試驗(yàn)

Y迷宮測(cè)試結(jié)果顯示, MCAO 組大鼠在各個(gè)時(shí)間段在學(xué)習(xí)記憶能力方面均明顯低于對(duì)照組

( P < 0101)。

 

214 T TC染色的結(jié)果大鼠術(shù)后第14天, T TC 染色的結(jié)果顯示:MCAO組大鼠的腦組織梗死灶明顯,對(duì)照組腦組織沒有明顯梗死灶(圖4) 。

 

本實(shí)驗(yàn)通過插線法制作大鼠短暫腦缺血模型,來(lái)觀察大鼠的神經(jīng)行為學(xué)能力、四肢協(xié)調(diào)功能和學(xué)習(xí)記憶能力3方面的損傷情況。從術(shù)后1 h至第14天,在大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分、攀繩實(shí)驗(yàn)和Y迷宮實(shí)驗(yàn)中,均發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組大鼠的顯著性差異( P< 0101) 。盡管隨著手術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng),這3項(xiàng)指標(biāo)均有所好轉(zhuǎn),但與對(duì)照組大鼠相比,差異始終具有顯著性,說(shuō)明了腦損傷的不可逆性。在手術(shù)后第14天,處死大鼠進(jìn)行腦組織T TC染色顯示了腦梗死體積仍然較大。梗死病灶的存在是大鼠行為學(xué)功能損傷的直接證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)所采用的攀繩實(shí)驗(yàn)曾被作為評(píng)價(jià)酒精中毒動(dòng)物的行為學(xué)損傷和評(píng)價(jià)外傷性腦損傷動(dòng)物的行為學(xué)改變的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在攀繩中的良好表現(xiàn)不但需要四肢的配合協(xié)調(diào)能力,而且還必須具有足夠的運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)能力。本實(shí)驗(yàn)中在14 d內(nèi)5次進(jìn)行測(cè)試,腦缺血大鼠在攀繩實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)有明顯的進(jìn)步,而有研究證實(shí)2周或4周測(cè)試1次顯示大鼠的行為學(xué)改善不明顯。這表明損傷后的功能鍛煉將有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中亦有類似的報(bào)道, 合理的解釋是損傷后的功能鍛煉能夠促進(jìn)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元神經(jīng)突觸的連接形成。目前,有關(guān)短暫局灶腦缺血對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響報(bào)道不一。有的學(xué)者認(rèn)為MCAO手術(shù)只造成腦組織紋狀體和皮層的損傷,而海馬組織不受影響,因此記憶能力不受影響; 有人認(rèn)為大鼠腦中參與學(xué)習(xí)和記憶的部位不僅限于海馬,皮層尤其是頂葉皮質(zhì)在動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶過程中起到非常重要的作用。而MCAO手術(shù)后會(huì)造成頂葉皮層的損傷,故會(huì)導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力降低。本實(shí)驗(yàn)中Y迷宮測(cè)試結(jié)果與對(duì)照組比較顯示腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力在手術(shù)后第3～14天顯著降低( P < 0101) 。作者認(rèn)為,除了頂葉皮質(zhì)損傷影響記憶功能外,可能的原因還有大鼠腦缺血過程中伴隨著大量炎性因子的釋放,包括氧自由基、一氧化氮等, 這些炎性因子的擴(kuò)散會(huì)造成海馬組織的損傷從而影響記憶功能,但并沒有造成海馬組織顯著的病理學(xué)改變。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)采用插線法制作的大鼠短暫腦缺血模型操作簡(jiǎn)單,效果可靠;術(shù)后動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)是一種半定量分析,具有敏感、客觀的特點(diǎn),能夠廣泛應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)研究。