酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)測定法

酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)測定法是一種在單細(xì)胞懸液中檢測分泌某種特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞和定量分析產(chǎn)生該特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞頻率的有力工具。1983年，Crekinsky等運用ELISPOT技術(shù)成功檢出分泌特異性抗體的細(xì)胞頻率，經(jīng)過不斷發(fā)展，目前該技術(shù)已廣泛用于檢測產(chǎn)生、分泌多種其他效應(yīng)分子的細(xì)胞(如細(xì)胞因子)。此方法操作簡便，但卻能提供非常類似于體內(nèi)實驗的環(huán)境，監(jiān)測T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因子，預(yù)測體內(nèi)免疫系統(tǒng)相應(yīng)的進(jìn)一步免疫反應(yīng)。在美國國家衛(wèi)生研究院的國立過敏和傳染病研究所的HIV疫苗試驗網(wǎng)絡(luò)(HVTN)與疫苗研究中心(VRC)的實驗室，ELISPOT方法被標(biāo)化和驗證，已經(jīng)用作檢測艾滋病毒疫苗免疫原性終點的一個主要方法。

基本原理和實驗方法及注意事項

1．基本原理和實驗方法

ELISPOT檢測的是可釋放細(xì)胞因子的活化T淋巴細(xì)胞的數(shù)目。在ELSPOT方法中，硝酸纖維素膜的96孔板中預(yù)先包被了抗細(xì)胞因子的抗體，T細(xì)胞和抗原或肽段共同在板孔中孵育，受到刺激后的T細(xì)胞會產(chǎn)生細(xì)胞因子，分泌的細(xì)胞因子因與板孔中預(yù)先包被好的抗體發(fā)生結(jié)合而聚集在細(xì)胞所處部位，再加入酶標(biāo)記的二抗，最后加入底物，就會形成不可溶的帶有顏色的斑點，一個斑點代表著一個能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞，這種方法較ELISA敏感200倍，無放射性，可以定量分析，精確性同LDA相當(dāng)(Miyahira et al_，1995)。

ELISPOT方法的基本原理一樣，但仍然會有一些變化，包括效應(yīng)細(xì)胞的種類，可以是外周血T淋巴細(xì)胞，也可以是體外培養(yǎng)的T細(xì)胞�？乖�刺激物可以是肽或者蛋白質(zhì)，抗原呈遞細(xì)胞有外周血單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞系，檢測的指標(biāo)可以是各種細(xì)胞因子或者顆粒酶B等。圖10．7說明了ELIPOT的原理和流程。

2．ELISPOT實驗注意事項

(1)ELISPOT試驗的檢測樣品和樣品的收集

ELISPOT試驗在體外模擬體內(nèi)的環(huán)境，檢測活化的免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的狀況，因此其檢測對象是具有功能的細(xì)胞。對于人、猴等靈長類動物，一般采用外周血新鮮分離后的單個核淋巴細(xì)胞，對于小鼠則多采用脾臟細(xì)胞。細(xì)胞的分離、保存、復(fù)蘇、培養(yǎng)、運輸以及檢測環(huán)境和具體的操作等多個環(huán)節(jié)都可能會影響細(xì)胞的活力和功能，如果不能確保細(xì)胞的活力和功能，便不能得到免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的真實試驗結(jié)果。目前外周血單個核細(xì)胞的分離方法通常是加入無鈣的PBS等滲緩沖液倍比稀釋外周血后，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離出細(xì)胞，整個操作過程必須在無菌條件下完成，往淋巴細(xì)胞分離液中加人稀釋的全血時應(yīng)緩慢滴加，并且在整個操作過程中都應(yīng)該輕拿輕放，避免人為地將稀釋全血與分離液混合。外周血一經(jīng)采集應(yīng)該立即進(jìn)行分離，據(jù)文獻(xiàn)報道，在室溫下儲存12h以上，再分離外周血單個核細(xì)胞，細(xì)胞的活力將有所下降(Kierstead eta1．，2007)。

分離后的細(xì)胞應(yīng)該盡快進(jìn)行ELISPOT試驗，否則需要用相應(yīng)的凍存方法將其放置在液氮內(nèi)保存，研究表明，在液氮內(nèi)保存180天的外周血單個核細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞的活性保持在80％以上，并且ELISPOT試驗的結(jié)果與新鮮分離細(xì)胞保持一致(Smith eta1．，2001)。目前許多疫苗的臨床試驗需要將不同地區(qū)的樣本集中在中心實驗室檢測，因此細(xì)胞的冷凍保存為此奠定了基礎(chǔ)，通過液氮運輸凍存的細(xì)胞保證了疫苗臨床試驗的完成。細(xì)胞運輸過程中溫度的波動變化是影響細(xì)胞活力的關(guān)鍵因素，為保證運輸和保存細(xì)胞溫度的一致性，應(yīng)使用液氮進(jìn)行運輸。

(2)ELISPOT試驗中陰性對照、陽性對照以及試驗孔的刺激物

通常免疫試驗都需設(shè)立陰性對照和陽性對照，ELISPOT試驗也是如此，其陰性對照為試驗細(xì)胞加上培養(yǎng)基，陽性對照為試驗細(xì)胞加上陽性刺激物，同時應(yīng)設(shè)立完全培養(yǎng)基對照，對于人、猴等靈長類動物，陽性刺激物可以選擇葡萄球菌腸毒素(staphylo-coccal enterotoxin B，SEB)、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)、CEF肽庫或者PMA和ionomycin(或A23187)的混合物。CEF是含有32條巨細(xì)胞病毒(cy-tomegolo virus，CMV)、EB病毒(epstein-barr virus，EBV)和流感病毒(inflLlenzavirus)來源的T細(xì)胞MHCⅠ類分子表位肽的混合物，其刺激反應(yīng)是一種特異性的反應(yīng)，與體外給予特異性肽段或抗原的刺激效果類似，并且不同的人對CEF的反應(yīng)不同(Mwau and McMichael，2002)。小鼠脾臟細(xì)胞多選用刀豆蛋白A(ConA)作為陽性刺激物。如果對陽性刺激物缺乏反應(yīng)，說明細(xì)胞在凍存或者復(fù)蘇中受損，該試驗細(xì)胞則不能進(jìn)行ELISPOT試驗。一般可以大量采集對以上刺激物有反應(yīng)的細(xì)胞，進(jìn)行分離凍存，在每次實驗時都復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行平行實驗作為陽性對照，并且該陽性對照也可以作為ELISPOT質(zhì)量控制的指標(biāo)。試驗孔細(xì)胞的刺激物為根據(jù)試驗的要求設(shè)計的特異性抗原或者肽庫，其刺激濃度根據(jù)抗原和肽庫性質(zhì)純度而定，一般情況下，肽庫的工作濃度為2ug／ml，蛋白質(zhì)的工作濃度為10ug／ml，實際工作中可以通過預(yù)試驗摸索得到最佳條件。

(3)試驗中其他因素對實驗結(jié)果的影響

目前ELISPOT檢測試劑有已經(jīng)包被好細(xì)胞因子捕獲抗體的反應(yīng)板，也有需要預(yù)先包被抗體的試劑，不同包被抗體的濃度會影響最終反應(yīng)的斑點，如果包被抗體的濃度過低，反應(yīng)斑點偏大，并且有彌散現(xiàn)象，隨著抗體濃度的增加，反應(yīng)斑點會逐漸清晰致密，因此，在每次試驗前需要預(yù)先摸索包被抗體的濃度或者根據(jù)說明書的建議進(jìn)行試驗。試驗孔細(xì)胞的數(shù)量會影響ELISPOT的試驗結(jié)果，一般每孔細(xì)胞的數(shù)量在20萬～40萬可形成最大密度的單層細(xì)胞(Smith et a1．，2001)。根據(jù)不同的試驗刺激物，可以相應(yīng)地調(diào)整試驗孔細(xì)胞的濃度，在非特異性刺激物(SEB、PHA、PMA、ionomycin或者ConA)的作用下，一般每孔細(xì)胞數(shù)量為0．5萬～5萬個，在特異性刺激物CEF肽庫、相應(yīng)的抗原或肽庫的作用下，一般每孔細(xì)胞數(shù)量為5萬～40萬個(Sylvia et a1．，2006)。

大多數(shù)細(xì)胞可以直接進(jìn)行ELISPOT試驗，不需要預(yù)先孵育，但是預(yù)先將細(xì)胞和刺激物進(jìn)行孵育，可以有效地去除巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞對實驗結(jié)果的影響，同時對于IL-10或者顆粒酶等，采用直接法很難得到較好的試驗結(jié)果，必須通過預(yù)孵育法才能得到較好的試驗結(jié)果。有文獻(xiàn)報道，凍存的細(xì)胞如果預(yù)先過夜孵育，可以更加有效地去除凋亡細(xì)胞的干擾(Marta et a1．，2007)。

細(xì)胞加入ELISPOT反應(yīng)板與刺激物共孵育的時間，一般在16h以上，最長可孵育至24h或更長。此外，在向反應(yīng)孔中加入細(xì)胞時應(yīng)緩慢垂直滴加，避免細(xì)胞聚集在板孔邊緣，建議每次實驗時先加入反應(yīng)刺激物后再加入細(xì)胞。對于底部為PVDF膜的反應(yīng)孔，在加樣時應(yīng)該避免接觸板孔的底部，以免損壞PVDF膜。在細(xì)胞加人反應(yīng)板后，應(yīng)該盡量避免振搖反應(yīng)板，防止反應(yīng)斑點的拖尾現(xiàn)象。雖然ELISPOT試驗相對其他細(xì)胞免疫檢測方法的操作步驟已經(jīng)相對簡單，其操作步驟幾乎和ELISA反應(yīng)相似，但是在其洗板的過程中仍然需要小心處理，目前有手工洗板和機(jī)器洗板，在手工洗板的過程中，每次洗板后，應(yīng)該輕扣反應(yīng)板以去除板孔內(nèi)多余的水分，猛烈扣板可能會導(dǎo)致反應(yīng)斑點的脫落。機(jī)器洗板可增加試驗效率，并且在進(jìn)行具有感染性試驗時可以保證實驗人員的安全，但是并不能保證無菌操作，因此在細(xì)胞孵育之前的洗板步驟需要手工洗板。此外，培養(yǎng)基的類型可以影響整個反應(yīng)的背景，如果選擇無血清的培養(yǎng)基可能會降低反應(yīng)孔的背景。

在ELISPOT的操作過程中，試驗中應(yīng)用的培養(yǎng)基、包被抗體濃度、檢測抗體濃度、孵育時間、洗板的操作及顯色的時間等每一個試驗環(huán)節(jié)都有可能影響試驗的結(jié)果，每個操作者可以根據(jù)實驗室的條件建立相應(yīng)的ELISPOT反應(yīng)條件，從而得到較理想的試驗結(jié)果。值得注意的一點是，不同實驗室對于同一種細(xì)胞因子需要進(jìn)行各自試驗條件的摸索，同一個實驗室在檢測不同細(xì)胞因子時，同樣應(yīng)該針對每一種細(xì)胞因子的試驗條件進(jìn)行探索。

(4)ELISPOT實驗結(jié)果的判斷、分析以及陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)

ELISPOT方法的缺點在于：人工操作計數(shù)造成的誤差、點的大小形狀變化造成的誤差以及實驗操作者主觀操作造成的誤差都會影響實驗結(jié)果。目前已有商品化計算機(jī)成像分析系統(tǒng)，大大增加了計數(shù)免疫斑點的精確性和速度。其中美國CTL公司產(chǎn)品占有率較高。通過分析斑點的形狀、大小、密度，可以排除非特異性斑點和確定單個T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量。

ELISPOT、試驗已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在HIV疫苗的臨床試驗中，用于評價HIV疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效果。ELISPOT試驗結(jié)果陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)目前分為三類：經(jīng)驗標(biāo)準(zhǔn)、Permutation-based resampling標(biāo)準(zhǔn)和Distribution-free resampling標(biāo)準(zhǔn)(Zoe et a1．，2006)。

經(jīng)驗標(biāo)準(zhǔn)的具體規(guī)定為：在每孔20萬個細(xì)胞中，加人相應(yīng)抗原或肽段刺激的反應(yīng)孔斑點形成細(xì)胞(SFC)的平均數(shù)量至少為11個，并且是陰性對照孔SFC平均數(shù)量的4倍，如果符合上述兩個條件，則試驗組為陽性反應(yīng)。經(jīng)驗標(biāo)準(zhǔn)是試驗者根據(jù)ELISPOT、的試驗經(jīng)驗得到的判斷陽性的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用相對簡單，但是存在一些不可避免的缺點，如經(jīng)驗標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性較差，根據(jù)經(jīng)驗標(biāo)準(zhǔn)得到的結(jié)果往往特異性和靈敏度都相對較差。ELISPOT、試驗的操作方法的各項條件是多樣化的，每個實驗室都不是完全相同的，而經(jīng)驗標(biāo)準(zhǔn)往往是根據(jù)某一特定試驗條件所制訂的標(biāo)準(zhǔn)。嚴(yán)格地講，試驗條件完全相同的實驗室才可以按照該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，如果試驗條件不同的實驗室都參照經(jīng)驗標(biāo)準(zhǔn)來判斷疫苗的細(xì)胞免疫效果，可能有些實驗室的判斷結(jié)果會有不準(zhǔn)確的信息存在。

Permutation-based resampling標(biāo)準(zhǔn)在經(jīng)驗標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用了統(tǒng)計學(xué)方法，相對地校正了經(jīng)驗標(biāo)準(zhǔn)的一些缺點。該標(biāo)準(zhǔn)的具體規(guī)定為：根據(jù)T=(YE-YC)/Sp得到P值，從而判斷結(jié)果。YE代表相應(yīng)抗原或肽段刺激的反應(yīng)孔斑點形成細(xì)胞(SFC)的平均數(shù)量，YE至少為10SFC/200 000個PBMC，Yc代表陰性對照孔SFC平均數(shù)量，SP代表標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)在一定程度上提高了檢測的特異性。

Distribution-free resampling標(biāo)準(zhǔn)是一種更新的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合了統(tǒng)計方法，計算比Permutation-based resampling標(biāo)準(zhǔn)更為簡單，并且該方法在一定程度上避免刺激肽庫中不同肽段的相互影響，可以更好地應(yīng)用在疫苗的臨床試驗上