Western Blot全自動(dòng)分析儀與傳統(tǒng)WB方法的比較

Western Blot全自動(dòng)分析儀與傳統(tǒng)WB方法的比較，傳統(tǒng)Western blot方法是利用抗原的免疫反應(yīng)，先將蛋白通過(guò)SDS-PAGE電泳分離開(kāi)來(lái)，然后再利用電場(chǎng)力的作用將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體（硝酸纖維素膜即NC膜）上，然后再加形成抗原復(fù)合物，利用發(fā)光或顯色原理將結(jié)果顯示到膜或底片上。其實(shí)驗(yàn)步驟主要包括以下幾個(gè)：

1、根據(jù)要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝膠（一般釆用10%的SDS－PAGE）
2、將已配制好的凝膠裝入電泳儀中（注意不要漏液）。
3、設(shè)計(jì)加樣順序，作好實(shí)驗(yàn)記錄，按預(yù)定順序加樣。一般裂解液我們按10-20ul/道點(diǎn)樣，重組蛋白按1-2ug/道點(diǎn)樣。
4、把電泳裝置與電源連接好，將電壓調(diào)至100V電泳10-20min，待溴酚藍(lán)遷移出積層膠位置再換用200V，30-40min后關(guān)閉電源。
5、從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板，用水沖洗干凈，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。
二．轉(zhuǎn)膜

1、 將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的容器中，浸泡幾分鐘。
2、 帶上手套，準(zhǔn)備好濾紙和NC膜，盡量避免污染濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中，驅(qū)除留于膜上的氣泡。
3、 打開(kāi)轉(zhuǎn)移盒并放置淺盤中，用轉(zhuǎn)移緩沖液將海綿墊完全浸透后將其放在轉(zhuǎn)移盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的濾紙。
4、 按“海綿—濾紙—凝膠—NC膜—濾紙—海綿”的順序裝置好（注意不能有氣泡且裝置電極槽不能放反）
5、將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液。
6、將整個(gè)裝置放在冰浴中用磁力攪拌器攪拌，連接好轉(zhuǎn)移電極恒流300mA轉(zhuǎn)移90min。電轉(zhuǎn)完畢后，將NC膜作好記號(hào)置于5%的脫脂奶粉（PBS配制）中封閉，37℃2小時(shí)或4℃過(guò)夜。

1．封閉：

將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒(méi)于封閉液中緩慢搖蕩一小時(shí)。必要時(shí)可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。

2．結(jié)合一抗：

一抗的準(zhǔn)備：使用反貼法時(shí)每張3×9cm²膜約需2ml一抗稀釋液。

反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時(shí)或4℃靜置過(guò)夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤(rùn)平皿以防止液體過(guò)多蒸發(fā)。

3．洗滌：

一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4．結(jié)合二抗：

根據(jù)一抗來(lái)源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體，按相應(yīng)比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖一小時(shí)。

5．洗滌：

二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

一最常用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記酶是辣根過(guò)氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，屬于過(guò)氧化物酶POD類）和堿性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase）顯色法。通常需要暗室，或?qū)�業(yè)的化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（）以及分析軟件進(jìn)行分析。

不難看出其步驟的繁雜性，這其中每一步的失誤都會(huì)造成全盤失敗，從而重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)于珍貴樣品，更是要倍加小心。另外，試驗(yàn)流程長(zhǎng)，結(jié)果重復(fù)性差，要達(dá)到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，成本也會(huì)很高。同時(shí)，所需實(shí)驗(yàn)儀器如，電泳、轉(zhuǎn)印、成像分析（或暗室）等的操作也較為復(fù)雜，增加了實(shí)驗(yàn)的難度。在傳統(tǒng)方法下，如果想得到一個(gè)較為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，往往需要實(shí)驗(yàn)者有著非常高超的實(shí)驗(yàn)技巧和嫻熟的實(shí)驗(yàn)儀器操作經(jīng)驗(yàn)。所以，科學(xué)家們一直在尋找一種革新的技術(shù)來(lái)克服Western傳統(tǒng)技術(shù)的不足，發(fā)揚(yáng)它的優(yōu)勢(shì)，直到2011年底，專門從事蛋白質(zhì)分析研究技術(shù)的美國(guó)ProteinSimple公司經(jīng)過(guò)多年開(kāi)發(fā)，在全球推出獨(dú)一無(wú)二的全自動(dòng)Western Blot分析系統(tǒng)Simon，從而使Western實(shí)驗(yàn)變得簡(jiǎn)單，高效。

全自動(dòng)Western Blot分析系統(tǒng)Simon將Western blot的所有實(shí)驗(yàn)步驟自動(dòng)化，包括蛋白上樣和分離、免疫印跡、洗滌、檢測(cè)以及數(shù)據(jù)的定量分析，即保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。

操作者只需簡(jiǎn)單的放上樣品，然后敲擊“開(kāi)始”，就可以離開(kāi)。只需約三個(gè)小時(shí)后，即可回來(lái)讀取已經(jīng)分析好的數(shù)據(jù)結(jié)果。，如果不確定整個(gè)過(guò)程的分析時(shí)間，Simon^TM在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后會(huì)以聲音提醒，一起就是如此簡(jiǎn)單！

它主要是在400nl樣品管中完成Western blot的所有實(shí)驗(yàn)，僅需5ul的樣品量，節(jié)約珍貴樣本；結(jié)果具有高度重復(fù)性，CV≤10%。自動(dòng)化上樣機(jī)具有多個(gè)參數(shù)可自行設(shè)定，包括分離時(shí)間、封閉時(shí)間、一抗和二抗孵育時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析是由Compass軟件自動(dòng)處理，樣品數(shù)據(jù)的表現(xiàn)形式與傳統(tǒng)的結(jié)果保持一致并具有更好的靈敏度與重復(fù)性。提高了分析系統(tǒng)定量的準(zhǔn)確性。

介紹完以上兩種方法，我們?cè)诖撕?jiǎn)單地總結(jié)Western Blot全自動(dòng)分析儀與傳統(tǒng)WB方法的比較：

一、      自動(dòng)化程度不同：傳統(tǒng)的WB方法需要跑膠、轉(zhuǎn)膜、抗體雜交以及發(fā)光成像與分析多個(gè)步驟，每個(gè)步驟都需要依靠經(jīng)驗(yàn)和摸索進(jìn)行，且每個(gè)步驟之間需要人工操作，直至得到分析結(jié)果。而全自動(dòng)WB分析儀僅需要簡(jiǎn)單的放入樣品和相應(yīng)程序的設(shè)置，然后有系統(tǒng)直接得出結(jié)果，整個(gè)過(guò)程全自動(dòng)化，實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單易操作。

二、      實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不同:傳統(tǒng)WB方法繁雜的實(shí)驗(yàn)步驟、較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期以及其幾乎全部手動(dòng)操作的實(shí)驗(yàn)方式直接決定了其較低的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。幾乎其中每一步的失誤都會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成差異性較大的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特別是對(duì)于初級(jí)實(shí)驗(yàn)操作人員，如果想得到較為可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果幾乎要接受大量的技能培訓(xùn)與許多次的失敗教訓(xùn)。

三、      實(shí)驗(yàn)時(shí)間（效率）不同：傳統(tǒng)WB方法需要幾乎兩天的時(shí)間，而全自動(dòng)Western blot分析儀僅需要數(shù)小時(shí)時(shí)間即可獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

四、      實(shí)驗(yàn)成本不同：傳統(tǒng)的WB方法需要樣品量較大，在幾乎完美無(wú)失誤的實(shí)驗(yàn)過(guò)程也需要多種較為高昂的實(shí)驗(yàn)試劑耗材及大量的時(shí)間和人力投入，如果實(shí)驗(yàn)失敗其實(shí)驗(yàn)成本有時(shí)幾乎不可預(yù)測(cè)。而全自動(dòng)Western blot分析儀僅需不超過(guò)5ul的樣品量和少量且經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)試劑耗材，在數(shù)小時(shí)內(nèi)即可獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)成本低廉且可估計(jì)，對(duì)于一些關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)幾乎最大程度的保證了實(shí)驗(yàn)方案甚至是項(xiàng)目的順利進(jìn)行。

當(dāng)然，Western Blot全自動(dòng)分析儀因其專業(yè)性強(qiáng)儀器購(gòu)置價(jià)格略微較高，目前其受眾僅為有著大量、專業(yè)、高效率實(shí)驗(yàn)需求的用戶。而普通WB方法中的各種儀器設(shè)備幾乎可以兼做其他各種凝膠成像實(shí)驗(yàn)，適用性更廣。