使用雜化顆粒C₁₈色譜柱和乙酸流動(dòng)相進(jìn)行肽的高載量研究

Matthew A.Lauber、Stephan M.Koza和Kenneth J.Fountain
沃特世公司(美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德市)

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

■兩種具備獨(dú)特選擇性的雜化顆粒色譜柱(BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈)。

■在使用最優(yōu)濃度的HOAc調(diào)節(jié)流動(dòng)相時(shí)，BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈獲得的目標(biāo)肽峰比使用0.1%TFA時(shí)更窄，分離度也更高。利用這一特性，可以通過更少的步驟獲得含有藥用反離子的肽。

■BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈由細(xì)胞色素c的胰蛋白酶消化液進(jìn)行質(zhì)控測(cè)試。

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC® H-ClassBio系統(tǒng)
XSelect™CSH130 C₁₈,5μm
XBridge™BEH130 C₁₈,5μm
MassPREP™肽混合物

關(guān)鍵詞
反相(RP)，肽，乙酸(HOAc)，表面帶電雜化顆粒(CSH)，CSH130 C₁₈，BEH130 C₁₈，制備型色譜，肽分離技術(shù)(PST)

簡(jiǎn)介
經(jīng)證實(shí)，肽在研究中是非常有用的治療劑和標(biāo)記物。通常，為了實(shí)現(xiàn)這些用途，會(huì)通過制備型反相(RP)色譜對(duì)肽進(jìn)行純化。在大多數(shù)情況下，純化出來的肽必須具有高純度。如果存在污染物，會(huì)干擾生物分析的結(jié)果。如果活性藥物成分中存在污染物，后果將會(huì)非常嚴(yán)重。因此，需要較高的色譜分辨率來盡量減少與目標(biāo)肽化學(xué)性質(zhì)非常接近的共洗脫雜質(zhì)。此外，還需要色譜柱填料具有卓越的載樣量，確保實(shí)現(xiàn)最佳的通量和生產(chǎn)率。肽分離使用的流動(dòng)相中通常包含強(qiáng)離子對(duì)試劑，例如三氟乙酸(TFA)。但是，如果選用含有TFA的流動(dòng)相，需要進(jìn)行額外的制備步驟。由于三氟乙酸鹽(TFA鹽)固有的毒性，必須將其除去或置換¹。最好使用毒性較低的反離子，尤如乙酸鹽。實(shí)際上，大部分肽藥都是乙酸鹽或含有乙酸的液體制劑^2-3。因此，盡可能用乙酸(HOAc)流動(dòng)相替代TFA流動(dòng)相，這種做法似乎更有優(yōu)勢(shì)。之前曾有研究表明，在使用HOAc流動(dòng)相和等度反相色譜后，TFA溶液中的肽(例如粗制合成肽)^4-5大部分轉(zhuǎn)化為乙酸鹽形式⁶。同時(shí)，使用高濃度乙酸鹽緩沖液通過簡(jiǎn)單的洗脫步驟進(jìn)行梯度分離，可實(shí)現(xiàn)更徹底的鹽形式轉(zhuǎn)化。⁷總之，使用HOAc流動(dòng)相可簡(jiǎn)化純化過程，有利于通過更少的步驟獲得所需肽和反離子。

本文研究了使用BEH C18和CSH™ C₁₈色譜柱進(jìn)行制備型肽分離的過程。BEH C18是一種有機(jī)硅C₁₈固定相，基于亞乙基橋雜化顆粒(BEH)技術(shù)，并具有卓越的耐用性和pH穩(wěn)定性。表面帶電雜化顆粒(CSH)C₁₈則是BEH C18的升級(jí)產(chǎn)品，其表面被修飾在酸性條件下帶有微弱正電荷。以下數(shù)據(jù)證明了這兩種固定相均適用于高上樣量的肽分離，既可用于TFA調(diào)節(jié)的流動(dòng)相，也可用于HOAc調(diào)節(jié)的流動(dòng)相。并且，在高上樣量下，BEH C18和CSH C₁₈在使用經(jīng)優(yōu)化的HOAc流動(dòng)相時(shí)獲得的目標(biāo)峰均比使用0.1%TFA時(shí)更窄。 

實(shí)驗(yàn)樣品
描述
將MassPREP肽混合物(部件號(hào)186002337，如表1所示)復(fù)溶于0.1%TFA或0.1%HOAc(取決于所用流動(dòng)相)中，使肽的總濃度為0.6或2.0mg/mL(取決于上樣量)。將合成肽的低純度(<70%)制備樣品DFVGYGVKDFVGVGVK復(fù)溶于0.1%TFA/0.1%HOAc中，使?jié)舛葹?或4mg/mL。 

方法條件(除非另有說明)

LC條件
系統(tǒng)：帶20-cm柱溫箱的ACQUITY UPLC H-ClassBio系統(tǒng)
檢測(cè)條件：帶500-nL分析型流通池的ACQUITY UPLC TUV檢測(cè)器
Xevo®G2 vQ-Tof™質(zhì)譜儀
波長(zhǎng)：214和250nm
掃描率：2Hz(過濾時(shí)間常數(shù)，1s)
色譜柱：XBridge BEH130 C₁₈4.6×100mm，5μm，多孔，130Å(部件號(hào)186003579)
XSelect CSH130 C184.6×100mm，5μm，多孔，130Å(部件號(hào)186007077)
柱溫：40℃
樣品溫度：10℃
進(jìn)樣體積：50至1000μL，上樣量見下文
流速：1mL/min(在UV檢測(cè)器后分流，以大約20μL/min注入MS源)
流動(dòng)相：參見梯度表
樣品瓶：LCGC認(rèn)證透明玻璃12×32mm螺口Qsert樣品瓶(部件號(hào)186001126C)

A：0.1%(v/v)HOAc水溶液
B：0.1%(v/v)HOAc的90:10ACN/水溶液
或
A：99:1(v/v)水/HOAc–1%HOAc
B：90:9:1(v/v)ACN/水/HOAc–1%HOAc

MS條件
質(zhì)譜儀：Xevo G2Q-Tof
電離模式：ESI+
分析儀模式：分離度
毛細(xì)管電壓：3.00kV
錐孔電壓：25V
源溫度：120°C
脫溶劑氣體溫度：350°C
錐孔氣體流速：0.0L/h
脫溶劑氣體流速：800L/h
校正：NaI，1μg/μL，50至2000m/z
采集：50至1990m/z，
2Hz掃描率

數(shù)據(jù)管理
MassLynx軟件4.1版

結(jié)果與討論
含有九種組分的肽混合物的載量研究
在之前的研究中，已經(jīng)對(duì)CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈在分析型肽分離中的應(yīng)用(例如肽圖繪制)進(jìn)行了廣泛的探討^8-9。簡(jiǎn)而言之，與其他肽分離反相填料相比，CSH130 C₁₈及其創(chuàng)新的表面帶電技術(shù)能夠改善峰形和載量。在分析型應(yīng)用中，尤其是在流動(dòng)相含有極少或不含離子對(duì)試劑時(shí)，可以觀察到峰容量有顯著升高，最高達(dá)到90%。與BEH130 C₁₈相比，CSH130 C₁₈的表面正電荷還提供了獨(dú)特的選擇性和較低的保留性，使得它們成為肽分離色譜填料的絕佳搭配。

為了研究CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈在制備型分離中的表現(xiàn)，采用生產(chǎn)中常用的流動(dòng)相(即含有TFA或HOAc的流動(dòng)相)對(duì)一系列不同肽進(jìn)行了載量研究。這些方法開發(fā)實(shí)驗(yàn)中使用的是5μm顆粒填充的分析柱(4.6mm內(nèi)徑)。

首先在這些色譜柱上進(jìn)行測(cè)試的是MassPREP肽混合物，其包含九種不同的肽，如表1所示。圖1所示為該混合物在半制備型上樣下的一組色譜圖，其中使用了BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈，以及兩種不同的流動(dòng)相，一種含有0.1%TFA，另一種含有0.1%HOAc。使用0.1%TFA時(shí)，BEH色譜柱的平均4峰寬為0.8min。使用0.1%HOAc時(shí)，平均峰寬幾乎翻了一倍，達(dá)到1.5min。HOAc的酸性比TFA弱得多，從而導(dǎo)致流動(dòng)相酸性減弱，離子強(qiáng)度和離子配對(duì)能力均顯著降低。因此預(yù)計(jì)使用HOAc代替TFA時(shí)，大部分C₁₈柱的峰形會(huì)較差。這一假設(shè)對(duì)于BEH130 C₁₈的半制備型上樣是成立的，如圖1所示。然而對(duì)于CSH130 C₁₈色譜柱，用HOAc替換TFA時(shí)峰形仍保持良好。使用0.1%TFA流動(dòng)相和0.1%HOAc流動(dòng)相時(shí)，在CSH130色譜柱中觀察到的平均4峰寬分別為0.5和0.6min。峰寬數(shù)據(jù)匯總于圖2中，其中分別繪出了在不同色譜柱類型和流動(dòng)相條件下混合物中每種肽的峰寬。除了半制備型上樣量的數(shù)據(jù)之外，圖中還顯示了分析型上樣量的數(shù)據(jù)。此圖表明BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈在一些條件下會(huì)生成類似的肽峰形，包括0.1%TFA的分析型上樣量。但是，在其他條件下，例如0.1%HOAc的半制備型上樣量，CSH130 C₁₈生成的峰要窄得多。正如之前研究所證實(shí)^8-9，CSH130 C₁₈在使用含有極少或不含離子對(duì)試劑的酸性流動(dòng)相時(shí)，獲得的肽峰形明顯更好。同時(shí)也表明，當(dāng)上樣量高于常規(guī)分析20倍時(shí)，這種現(xiàn)象更為明顯。

低純度合成肽
制備型分離往往要求上樣量必須達(dá)到(有時(shí)要高于)分析型分離所用上樣量的1000倍。使用序列為DFVGYGVKDFVGVGVK的低純度合成肽(一種中性肽，pI=6，1.7kDa)，對(duì)低于此范圍和此范圍之內(nèi)的上樣量進(jìn)行研究。在BEH和CSH色譜柱上采用聚焦梯度分離以縮短運(yùn)行時(shí)間，使用低靈敏度波長(zhǎng)(250nm)檢測(cè)以獲取完整峰形。

首先使用經(jīng)0.1%HOAc調(diào)節(jié)的流動(dòng)相對(duì)半制備型和制備型上樣量進(jìn)行分析，如圖3所示。BEH色譜柱上的半制備型上樣量(50μg)產(chǎn)生的目標(biāo)肽峰帶有明顯拖尾，這與常見的Langmuirian等溫線一致。相反，在制備型上樣量(1mg)下，目標(biāo)肽的洗脫峰呈略微前伸，正如典型的anti-Langmuirian等溫線。我們知道，當(dāng)肽以兩性離子形式存在時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)anti-Langmuirian等溫線¹⁰。由此可知，經(jīng)0.1%HOAc調(diào)節(jié)的流動(dòng)相酸性不足以將這種合成肽的羧基完全質(zhì)子化，肽可能同時(shí)以陽離子和兩性離子存在。兩性離子的相對(duì)含量應(yīng)隨上樣量增大而增大，尤其是在目標(biāo)肽濃度超過流動(dòng)相的質(zhì)子化/緩沖能力情況下。這就解釋了BEH色譜柱上樣量增大時(shí)峰形出現(xiàn)的巨大變化。

有趣的是，正如在圖3中所看到的，對(duì)于BEH130 C₁₈，在制備型上樣量下使用0.1%HOAc似乎更容易獲得較窄的目標(biāo)肽峰。在這些條件下，BEH色譜柱得到的目標(biāo)肽峰比CSH色譜柱更窄。事實(shí)上，CSH130 C₁₈使用0.1%HOAc時(shí)在兩種上樣量下都獲得了前伸峰。由于其表面所帶的正電荷最大程度地減少了肽的拖尾，所以出現(xiàn)這種情況是意料之中的^8-9。因此，前伸峰形也更加明顯。由于沒有拖尾峰，制備型上樣量下CSH柱的目標(biāo)峰寬度實(shí)際上要大于BEH柱。

基于此，CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈生成最佳峰形的流動(dòng)相條件應(yīng)該有所不同。為此，還使用10倍酸性的酸(1%HOAc)調(diào)節(jié)的流動(dòng)相進(jìn)行了分離。盡管中等濃度對(duì)于開發(fā)純化工藝可能具有一定參考價(jià)值，但此處未對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。如圖3所示，改變流動(dòng)相組分后，CSH柱的峰形大大改善，但BEH柱的峰形變得更差。使用二者各自的最佳HOAc流動(dòng)相時(shí)，BEH柱(0.1%HOAc)和CSH柱(1%HOAc)都能生成較窄的目標(biāo)肽峰(半峰寬分別為0.5和0.6min)。為了參照，使用0.1%TFA作為離子對(duì)試劑進(jìn)行了分離，如圖3中右側(cè)所示。在使用TFA時(shí)，CSH130 C₁₈上的目標(biāo)肽峰寬為0.6min，BEH130 C₁₈上則為1.1min。無論選用哪種色譜柱填料，使用優(yōu)化的HOAc流動(dòng)相獲得的肽目標(biāo)峰都遠(yuǎn)遠(yuǎn)窄于TFA流動(dòng)相。這些結(jié)果表明，乙酸流動(dòng)相對(duì)于肽制備型分離更為實(shí)用。

較窄的目標(biāo)肽峰往往伴隨著更高的雜質(zhì)分離度，從而有機(jī)會(huì)收集到純度更高的流分。色譜柱填料和流動(dòng)相添加劑對(duì)DFVGYGVKDFVGVGVK制備型上樣量的影響如圖4所示，其中重點(diǎn)顯示了基線以及每種分離方法對(duì)目標(biāo)峰中雜質(zhì)的分離能力，這些雜質(zhì)已通過MS確認(rèn)。如前所述，HOAc流動(dòng)相獲得的目標(biāo)峰更窄。圖4還表明，使用HOAc流動(dòng)相也在最大程度上減少了所監(jiān)測(cè)雜質(zhì)的共洗脫。此外，很明顯可以看出，通過使用不同的流動(dòng)相添加劑和兩種不同的色譜柱填料，目標(biāo)肽和雜質(zhì)之間的色譜選擇性發(fā)生了極大的變化。就此項(xiàng)載量研究篩選的參數(shù)而言，采用1%HOAc流動(dòng)相的CSH柱提供的目標(biāo)肽峰最窄，并且所監(jiān)測(cè)雜質(zhì)的共洗脫也最少。不過，使用BEH色譜柱和0.1%HOAc流動(dòng)相也能獲得與此相當(dāng)?shù)姆蛛x效果。具有不同選擇性和最佳添加劑濃度的色譜柱填料將會(huì)有利于高難度制備型分離工藝的開發(fā)。

以上我們僅對(duì)合成肽的中等制備型上樣量(1mg)結(jié)果進(jìn)行了討論。圖5所示為4mg肽上樣得到的色譜圖。這一上樣量對(duì)應(yīng)0.5g原料，對(duì)于較大的50mm內(nèi)徑色譜柱，這是非常高的單次進(jìn)樣生產(chǎn)率。從這些數(shù)據(jù)可以明顯看出，CSH和BEH色譜柱都適合用于高上樣量。值得注意的是，從半制備型(50μg)到制備型(4mg)，CSH色譜柱獲得的峰形保持了驚人的一致。當(dāng)需要在不消耗大量樣品前提下開發(fā)分離方法時(shí)，這種高度可預(yù)測(cè)性可能會(huì)非常有用。

結(jié)論
根據(jù)對(duì)分析型內(nèi)徑色譜柱進(jìn)行的載量研究，5-μm BEH130 C₁₈和5-μm CSH130 C₁₈在使用含TFA或HOAc的流動(dòng)相時(shí)均顯示出有利于制備型肽分離的巨大潛力。BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈色譜柱都具備有益特性。在酸性條件下，CSH130 C₁₈與BEH130 C₁₈相比顯示出更高的載樣能力，并且通常能產(chǎn)生更窄的目標(biāo)峰。因此，CSH130 C₁₈流分體積更少，這一特性對(duì)后續(xù)的純化和去溶劑步驟可能會(huì)有幫助。BEH130 C₁₈則極適于中性/堿性pH環(huán)境下的制備分離，因其在此類條件下具有更長(zhǎng)更高的溫度穩(wěn)定性。最后，CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈還各自表現(xiàn)出獨(dú)特選擇性，成為解決高難度雜質(zhì)/目標(biāo)肽分析問題的有效搭配。

比上述特性更引人注意的是，兩種固定相分別在不同濃度的流動(dòng)相添加劑下對(duì)制備級(jí)上樣量的合成肽取得了最佳效果。使用優(yōu)化的HOAc時(shí)取得的峰形最佳，比使用0.1%TFA效果更好。這意味著可以利用這些雜化顆粒C₁₈色譜柱簡(jiǎn)化純化工藝，因?yàn)槭褂肏OAc流動(dòng)相可用更少的步驟即獲得含有藥用反離子的肽。

References
1. Cornish J, Callon KE, Lin CQ, Xiao CL, Mulvey TB, Cooper GJ, Reid IR. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. Am J Physiol. 1999; 277 (5 Pt 1): E779-83.
2. Pini A, Lozzi L, Bernini A, Brunetti J, Falciani C, Scali S, Bindi S, Di Maggio T, Rossolini GM, Niccolai N, Bracci L. Efficacy and toxicity of the antimicrobial peptide M33 produced with different counter-ions. Amino Acids. 2012; 43(1): 467-73.
3. Reichert JP, Tartat A, Dunn MK. Development trends for peptide therapeutics: A comprehensive quantitative analysis of peptide therapeutics in clinical development. Peptide Therapeutics Foundation. 2010.
4. Fields GB, Carr SA, Marshak DR, Smith AJ, Stults JT, Williams LC, Williams KR, Young JD. In Techniques in Protein Chemistry IV. Hogue-Angeletti R, Ed. San Diego, 1993; 229-237.
5. Kent, SBH. Chemical Synthesis of Peptides and Proteins. Ann. Rev. Biochem. 1988; (57): 957-989.
6. Roux S, Zekri E, Rousseau B, Paternostre M, Cintrat JC, Fay N. Elimination and exchange of trifluoroacetate counter-ion from cationic peptides: a critical evaluation of different approaches. J Pept Sci. 2008; 14 (3): 354-9.
7. Alon H, Butilca GM, Eidelman C, Elster S, Ivchenko A, Shusman S, Tovi A, Zaoui GA. Counterion Exchange Process for Peptides. Patent Pending, 2006; 2010.
8. Lauber MA, Koza SM, Fountain KJ. Peptide Mapping and Small Protein Separations with Charged Surface Hybrid (CSH) C18 and TFA-Free Mobile Phases. Waters Application Note 720004571en. 2013 January.
9. Lauber MA, Koza SM, Fountain KJ. Increasing Peak Capacity in Reversed-Phase Peptide Separations with Charged Surface Hybrid (CSH) C18 Columns. Waters Application Note 720004568en. 2013 January.
10. Gritti F, Guiochon G. Adsorption behavior of the three species of the biprotic peptide Phe-Ala onto an end-capped C18-bonded organic/inorganic hybrid stationary phase. Anal Chem. 2009; 81(24): 9871-84.