采用CORTECS UPLC HILIC色譜柱開發(fā)ACh、HA及其代謝產(chǎn)物的UPLC/MS/MS定量測定法

采用CORTECS UPLC HILIC色譜柱開發(fā)一種能夠?qū)θ四X脊液(CSF)中乙酰膽堿、組胺及其代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定量分析的UPLC/MS/MS定量測定法，從而提高峰分離度、靈敏度和分析速度

MaryE.Lame、ErinE.Chambers和KennethJ.Fountain 
沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德)

應(yīng)用優(yōu)勢
■ CORTECS™UPLC® HILIC色譜柱的分離度可實(shí)現(xiàn)對ACh、HA及其代謝產(chǎn)物的同時(shí)定量
■ 總運(yùn)行時(shí)間僅2.5min，符合高通量篩查需求
■ 96孔板的應(yīng)用簡化了樣品制備(小于15min)
■ 較之先前的報(bào)道方法，高靈敏度的Xevo® TQ-SMS允許所用樣品體積更小，稀釋倍數(shù)更高

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC®系統(tǒng)
Xevo TQ-S質(zhì)譜儀
CORTECS UPLC HILIC色譜柱
ACQUITY®收集板

關(guān)鍵詞
生物分析，生物標(biāo)記物，腦脊液，定量，神經(jīng)遞質(zhì)，乙酰膽堿，膽堿，組胺，t-甲基組胺，t-甲基咪唑醋酸，UPLC，HILIC，CORTECS

簡介
在藥物研發(fā)中，來自體液的生化標(biāo)記物常被用作診斷疾病和評估藥物療效的有效方式。乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)和組胺(Histamine,HA)是強(qiáng)極性神經(jīng)遞質(zhì)，存在于幾乎所有哺乳動(dòng)物組織中。它們在睡眠調(diào)節(jié)、記憶、學(xué)習(xí)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著一定作用^1-3。大腦中ACh水平下降會導(dǎo)致記憶功能障礙，尤其是阿爾茨海默氏癥患者的ACh供應(yīng)明顯不足¹。因此，在這類認(rèn)知障礙的治療中對于如何促進(jìn)ACh的釋放進(jìn)行了廣泛的研究。

組胺由組氨酸的脫羧作用生成。組胺或是被儲存起來，或是被其主要的降解酶組胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶或二胺氧化酶迅速滅活并代謝為兩種主要代謝產(chǎn)物t-甲基組胺(t-mHA)和τ-甲基咪唑醋酸(t-MIAA)。腦內(nèi)組胺參與廣泛的生理功能，例如睡眠-覺醒周期調(diào)節(jié)、喚醒、食欲控制、認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶^2,3。據(jù)了解，在精神分裂癥患者腦脊液中組胺的代謝產(chǎn)物增多^4,5。因此，腦脊液(CSF)中HA、t-mHA和t-MIAA的濃度可以作為腦組胺活性的指標(biāo)。鑒于ACh、HA及其各自的代謝產(chǎn)物具有重要的生理學(xué)作用，其生理濃度變化的測量可作為疾病進(jìn)展或藥物治療的評估指標(biāo)，這一功能使得這類物質(zhì)成為藥物研發(fā)中非常重要的生化標(biāo)記物。

開發(fā)ACh、HA及其代謝產(chǎn)物的靶向分析方法是人們一直以來面臨的挑戰(zhàn)，因?yàn)樗�不僅需要具備高靈敏度和高選擇性，還需要具有較快的樣品分析速度。此外，ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物之間的內(nèi)源性循環(huán)濃度存在極大差異，使得同時(shí)測定這些物質(zhì)需要較寬的定量動(dòng)態(tài)范圍。雖然目前有多種用于定量這類分析物分析方法(GC/MS，HPLC-EC和LC/MS)^6-8，但很少有方法能夠同時(shí)測定嚙齒動(dòng)物腦微透析液或CSF基質(zhì)中的ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物⁹。在含較高水相的洗脫條件下，分析物與基質(zhì)抑制組分可能會共流出并且MS電離能力較差，使得反相(RP)液相色譜法結(jié)合MS檢測的方法因靈敏度較低而受到限制¹⁰。親水作用液相色譜(HILIC)能夠提高極性物質(zhì)的色譜保留性能，可與反相色譜進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)用于極性和可電離化合物的分離，并能改善質(zhì)譜響應(yīng)，正日益成為應(yīng)對這些極性分析物分離挑戰(zhàn)的不二之選。

本文中介紹的方法展示了在96孔板中同時(shí)定量人CSF中的ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物。利用一步法樣品制備技術(shù)制備樣品，取20µL樣品進(jìn)行稀釋，再執(zhí)行HILICUPLC/MS/MS分析。采用亞2µm顆粒的高效CORTECS UPLC HILIC色譜柱能夠?qū)崿F(xiàn)分析物與內(nèi)源性基質(zhì)的分離，提高分析靈敏度，分析時(shí)間只需2.5min，因此本方法快速、靈敏、準(zhǔn)確且選擇性好，符合藥物開發(fā)的高通量生物分析需求。

實(shí)驗(yàn)

樣品制備
20µL人工腦脊液(aCSF)標(biāo)準(zhǔn)品、aCSF質(zhì)量控制(QC)樣品或人腦脊液(含4mM毒扁豆堿)將QC樣品轉(zhuǎn)移至1mL的96孔板中。向樣品中加入含有濃度分別為1ng/mL的d4-乙酰膽堿、d4-組胺、d3-t-甲基組胺和d3-t-甲基咪唑醋酸(用作內(nèi)標(biāo)(ISTD))的乙腈100µL。蓋上96孔板，并進(jìn)行渦旋混合。然后，將樣品在4000rpm下離心5min，取10µL樣品進(jìn)行UPLC/MS/MS分析。

UPLC條件
系統(tǒng)：  ACQUITY UPLC
色譜柱：CORTECS UPLC HILIC1.6µm，2.1mmX100mm(部件號186007106)
流動(dòng)相A：100mM甲酸銨，pH3
流動(dòng)相B： 乙腈
梯度：初始為90%的流動(dòng)相B，在0.75min內(nèi)線性增加至60%，保持0.25min，然后在0.25min內(nèi)線性減少至30%，并保持0.65min。最后在1.9min內(nèi)返回至初始條件。
流速： 0.5mL/min
柱溫： 45℃
樣品溫度：6℃
進(jìn)樣體積：10µL
運(yùn)行時(shí)間：2.5min
收集板： Waters® ACQUITY1mL收集板

MS條件
質(zhì)譜儀：Xevo TQ-S
電離模式：ESI+
毛細(xì)管電壓：3.0kV
脫溶劑氣溫度：550℃
錐孔氣體流速：150L/h
脫溶劑氣流速：900L/h
碰撞室壓力：3.58X10 ^(-3)mbar
碰撞能量： 按組分優(yōu)化，見表1
錐孔電壓： 按組分優(yōu)化，見表1

數(shù)據(jù)管理
色譜分析：MassLynx®軟件
定量：   TargetLynx™軟件

結(jié)果與討論

質(zhì)譜分析
利用沃特世Xevo TQ-S質(zhì)譜儀在ESI-MS/MS正離子模式下對ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測和定量。使用MassLynxIntelliStart™軟件自動(dòng)優(yōu)化針對ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物和相應(yīng)的氘代穩(wěn)定同位素標(biāo)記形式(作為內(nèi)標(biāo))所選擇的多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)通道，如表1所示。每個(gè)MRM通道駐留時(shí)間短至25ms，以及MS系統(tǒng)的快速掃描時(shí)間，使其能夠同時(shí)采集所有化合物峰并達(dá)到每峰數(shù)據(jù)點(diǎn)>/=10。

UPLC分離
ACh、Ch、HA、t-mHA和t-MIAA是以相對較低濃度存在的強(qiáng)極性小分子化合物，這使其難以通過常規(guī)的反相色譜進(jìn)行檢測。此外，由于共流出的相關(guān)分子(如鹽類或其它低分子量內(nèi)源性組分)的基質(zhì)誘導(dǎo)干擾和離子抑制作用，導(dǎo)致對生物基質(zhì)中的這些內(nèi)源性分析物進(jìn)行定量分析常常較為困難⁹。

在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們利用亞2µmCORTECS UPLC HILIC色譜柱和ACQUITY UPLC系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物的色譜分離。確定最適宜的甲酸銨濃度(流動(dòng)相A)為100mM(pH3)，流動(dòng)相B由乙腈組成。在最佳流速為0.5mL/min、梯度為30%-90%B時(shí)，其在45℃的柱溫下分析循環(huán)時(shí)間為2.5min。

流動(dòng)相添加劑的濃度對方法特異性、靈敏度以及將目標(biāo)分析物與流動(dòng)相和內(nèi)源性基質(zhì)進(jìn)行色譜分離的能力具有重要影響。較高的緩沖液濃度100mM(而不是20至50mM)極大地改善了后洗脫分析物的峰寬。特別是高mM濃度的甲酸銨使t-MIAA的峰拖尾現(xiàn)象顯著減少。定量下限控制標(biāo)準(zhǔn)品(LLQC)中的ACh、Ch及其各自代謝產(chǎn)物，色譜保留時(shí)間和性能如圖2所示。ACh、Ch及其各自代謝產(chǎn)物和ACh的同分異構(gòu)體Iso-ACh(3-羧丙基)三甲基銨在1.35至1.75min內(nèi)洗脫，基線峰寬小于3.7s。

由于Iso-ACh(3-羧丙基)三甲基銨在腦中以較高濃度存在，因此本研究對其進(jìn)行了分析。據(jù)報(bào)道，它是肉毒堿生物合成中的酶(G-甜菜堿羥化酶)的底物11。ACh和Iso-ACh為同分異構(gòu)體，在進(jìn)行CSF中ACh的準(zhǔn)確定量時(shí)確保二者的色譜分離度相當(dāng)重要。在人CSF樣品提取物中(圖3)，突顯了存在的高濃度內(nèi)源性Iso-ACh。將ACh以1000pg/mL的濃度加標(biāo)至人CSF中，以展示ACh和Iso-ACh之間的色譜分離和濃度差異。

樣品制備
選擇人工CSF(aCSF)作為替代基質(zhì)用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對所有分析物進(jìn)行定量。aCSF較容易獲得，且花費(fèi)不像人CSF那樣高昂，因此，將其作為替代基質(zhì)更為實(shí)際。為了確保aCSF可作為合適的基質(zhì)用于所有分析物的準(zhǔn)確定量，我們制備了ACh、HA和t-mHA的加標(biāo)人CSFQC樣品，以及Ch和t-MIAA的aCSFQC樣品。Ch和t-MIAA的QC樣品由aCSF配制，是因?yàn)槿薈SF中內(nèi)源性基底水平的ng/mL濃度較高，使得難以通過標(biāo)準(zhǔn)品加入法在適用于其它分析物測定的線性范圍內(nèi)進(jìn)行定量，因此需使用aCSF制備Ch和t-MIAA的QC樣品。此外，人CSF中Ch的ng/mL濃度較高，因此需要采用aCSF對樣品進(jìn)行稀釋以便在動(dòng)態(tài)檢測范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

如Zhang、Tingley、Tseng等人所述，所有人CSFQC樣品和人CSF樣品均含有最終濃度為4mM的穩(wěn)定劑毒扁豆堿，用于阻止ACh經(jīng)酶轉(zhuǎn)化為Ch和醋酸鹽。標(biāo)準(zhǔn)曲線、人CSFQC樣品、aCSFQC樣品和樣品均采用1mL96孔板制備。通過加入含實(shí)驗(yàn)部分所述內(nèi)標(biāo)的乙腈，進(jìn)行一步法樣品稀釋(樣品量：乙腈量1：5)。使用96孔板可以在15min內(nèi)完成樣品制備，滿足了開發(fā)定量分析方法所需的高通量分析要求。

線性、精度和準(zhǔn)確度
使用ACh、HA、t-mHA和t-MIAA的氘代穩(wěn)定同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品(ISTD)進(jìn)行定量分析。用d4ACh內(nèi)標(biāo)進(jìn)行Ch定量。ACh、Ch、HA、t-mHA和t-MIAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(1/x加權(quán))在定量動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)呈線性(>0.99)。各分析物的動(dòng)態(tài)范圍、線性、平均QC準(zhǔn)確度和定量下限(LLOQ)如表2所示。ACh的代表性校準(zhǔn)曲線示于圖4中。

以人CSF和aCSF的混合物為基質(zhì)制備QC樣品，用于評估樣品內(nèi)精度和重現(xiàn)性。通過分析未加標(biāo)的人CSF，測定ACh、HA和t-mHA的基底水平。通過從CSF源中扣除平均基底水平濃度得出相應(yīng)的QC水平，從而測得QC濃度。ACh、HA和t-mHA的加標(biāo)人CSFQC樣品分析，以及Ch和t-MIAA的加標(biāo)aCSFQC樣品分析的代表性結(jié)果如表3和4所示。aCSF和人CSF校準(zhǔn)定量完成后，利用aCSF標(biāo)準(zhǔn)曲線測定人CSF中各分析物的內(nèi)源性基底濃度。ACh、Ch、HA、t-mHA和t-MIAA的基底水平平均測定值匯總于表5中。準(zhǔn)確度和精度值符合FDA關(guān)于LC/MS/MS檢測的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)^12,13。

結(jié)論  
■ 這種快速、簡單、靈敏且高選擇性的UPLC分析方法能夠?qū)θ薈SF中的ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離和同時(shí)定量。
■ 使用96孔板可以在15min內(nèi)完成樣品制備，提供了研發(fā)  階段分析方法所需的高分析通量。
■ CORTECS UPLC HILIC色譜柱的分離度和靈敏度改善了內(nèi)源性基質(zhì)組分的分離和分離度，所用分析時(shí)間僅2.5min。
■  Xevo TQ-SMS的高靈敏度使得只需少量樣品(20µL)和5倍的稀釋，即可達(dá)到低至10pg/mL的檢測限，并具有寬的定量動(dòng)態(tài)范圍10-30000pg/mL。
■  所有分析物的QC樣品分析結(jié)果均符合FDA法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，變異系數(shù)為0.3%-10.1%，準(zhǔn)確度范圍94.7%-113.7%，表明本方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度良好。
■本文所介紹的方法展示出在藥物開發(fā)的研發(fā)階段對多種神經(jīng)性生物標(biāo)記物進(jìn)行高選擇性和高靈敏度定量的潛力。

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