食品中肉毒桿菌的檢驗(yàn)方法淺析
肉毒桿菌是一種生長在缺氧環(huán)境下的致病菌，全稱肉毒梭狀桿菌，在罐頭食品及密封腌漬食物中具有極強(qiáng)的生存能力。它在繁殖過程中所分泌的毒素具有極強(qiáng)的毒性，是氰化鉀毒性的一萬倍，是毒性最強(qiáng)的毒素之一。純化結(jié)晶的肉毒桿菌毒素 1 mg 能殺死 2 億只小鼠，對人的半致死量為 40 IU/kg。
肉毒桿菌毒素（Botulinum Toxin）前體是在肉毒桿菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的無毒化合物，肉毒桿菌死亡后無毒化合物釋放出來，經(jīng)腸道中的胰蛋白酶或細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶激活后方始具有毒性。 肉毒桿菌毒素作用的機(jī)理是阻斷神經(jīng)末梢分泌能使肌肉收縮的乙酰膽堿，從而達(dá)到麻痹肌肉的效果。人們食入和吸收這種毒素后，神經(jīng)系統(tǒng)將遭到破壞，將會出現(xiàn)頭暈、呼吸困難和肌肉乏力等癥狀。
新西蘭乳制品巨頭恒天然集團(tuán)8月3日宣布，旗下部分嬰兒奶粉和運(yùn)動飲料等產(chǎn)品可能 “受到污染”，含有肉毒桿菌。多家食品廠商產(chǎn)品受到影響。RephiLe 技術(shù)人員根據(jù)《GB/T4789.12-2003食品中衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)肉毒桿菌及內(nèi)毒素檢驗(yàn)》和《SN/T 2525-2010 食品中肉毒梭菌的PCR 檢測》總結(jié)出了對食品中肉毒桿菌進(jìn)行初步檢驗(yàn)的方法。
一、實(shí)驗(yàn)原理
將樣品經(jīng)增菌后劃平板分離單菌落，挑取可疑菌落到胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯 (TPGY)培養(yǎng)基培養(yǎng)，對培養(yǎng)物用 DNA 提取試劑盒抽提 DNA，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn) PCR 產(chǎn)物中是否含有肉毒桿菌的的特征條帶，從而初步判斷食品是否被肉毒桿菌污染。
二、儀器和試劑
紫外檢測儀 NanoDrop1000 (Eppendorf)，臺式微量冷凍離心機(jī) Microfuge 22R（Beckman Counter），凝膠成像分析系統(tǒng) Gel DocTM XR （Bio-RAD）， PCR儀 My Cycler （Bio-RAD），Direct-Pure UP 超純水系統(tǒng)（RephiLe），核酸電泳儀 EPS100 (上海天能)。
細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒（Axygen），dNTP （Takara）
三、試驗(yàn)方法
1、樣品制備和增菌培養(yǎng)
接種前，先將增菌培養(yǎng)基煮沸 10 ~ 15 min，以排除溶解于培養(yǎng)基中的氧，并迅速冷卻，切勿搖動。每 15 ml 增菌肉湯中接種 1 ~ 2 g 固體食品或 1 ~2 ml 液體食品，接種時將接種物慢慢接入肉湯液面以下。每份樣品接種兩管庖肉培養(yǎng)基，置 35 ℃±1 ℃，同時接種兩管 TPYG 培養(yǎng)基，置 28 ℃±1 ℃，厭氧培養(yǎng) 5 d。檢查培養(yǎng)物的濁度、產(chǎn)氣、肉粒的消化和產(chǎn)生的氣味。若有生長，按步驟 2 分離純化培養(yǎng)物。若未見生長，則繼續(xù)培養(yǎng) 10 d。
2、分離純培養(yǎng)物
取 1 ~ 2 ml 培養(yǎng)液置于無菌試管中，加入等量無菌無水乙醇，混勻，放置室溫 1 h。用接種環(huán)取 1 ~ 2 環(huán)經(jīng)處理過的培養(yǎng)物在厭氧卵黃瓊脂上劃線接種，35 ± 1 ℃ 下厭氧培養(yǎng) 48 h。接種可疑菌落到 TPGY 培養(yǎng)基，35 ± 1℃ 下厭氧培養(yǎng) 24 h。
3、DNA 模板制備及濃度測定
取1.4 ml TPGY 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到 1.5 ml 離心管中，14000 r/min 離心 2 min，棄去上清液。沉淀使用商品化細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒提取 DNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。提取的 DNA 進(jìn)行純度和濃度測定后置于 -20 ℃ 保存。
4、PCR 擴(kuò)增
采用分別針對 A、B、E、F 型肉毒梭菌肉毒毒素基因設(shè)計的型特異性引物（見附表1），進(jìn)行多個 PCR 擴(kuò)增，每個 PCR 反應(yīng)管檢測一種類型的肉毒梭菌。PCR 反應(yīng)體系和參數(shù)見附表 2 和表 3。反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。PCR 檢測時反應(yīng)體系應(yīng)設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。用 A、B、E、F 型肉毒梭菌的基因組 DNA 作陽性對照，用非肉毒梭菌基因組 DNA 作陰性對照，用無菌超純水作空白對照。
5、凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物
用 0.5 X TBE Buffer 制備 1.2%~1.5% 的瓊脂糖凝膠（凝膠加熱融化后冷卻至 60 ℃ 左右加入 EB 至 0.5 μg/ ml），將 10 μL 的 PCR 產(chǎn)物與 2.0 μL 6 X 加樣緩沖液混合，上樣，最左邊孔道加 DNA Marker。0.5 X TBE Buffer，10 V/cm 恒壓電泳，根據(jù)溴酚藍(lán)的移動位置確定電泳時間，電泳檢測結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)判讀。
6、PCR 結(jié)果判定
陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，待測樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判定為 PCR 結(jié)果陽性，按 GB/T4789.12-2003 進(jìn)行確證試驗(yàn)。
待測樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判定 PCR 結(jié)果為陰性，直接報告結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的陰性對照、空白對照和陽性對照 PCR 檢測結(jié)果應(yīng)符合上述情況，否則，任一種對照如果出現(xiàn)非上述正常結(jié)果，應(yīng)重做實(shí)驗(yàn)。
表1 肉毒梭菌肉毒毒素基因 PCR 檢測的引物序列
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檢測肉毒梭菌類型 |
引物序列 |
擴(kuò)增長度/ bp |
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A 型 |
正：5’-GTGATACAACAAGATGGTAGTTATAG-3’
反：5’-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3’ |
983 |
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B 型 |
正：5’-GAGATGCTTTGTGAATATTATGATCCAG-3’
反：5’-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3’ |
492 |
|
E 型 |
正：5’-CGAGGCGGTTGTCAACAATTTTAT-3’
反：5’-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3’ |
410 |
|
F 型 |
正：5’-GCTTCATTAAAGACGGAAGCAGTGCT-3’
反：5’-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3’ |
1137 |
表2 肉毒梭菌毒素 PCR 檢測的反應(yīng)體系
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試劑 |
終濃度 |
加入體積/μL |
|
10 X PCR Buffer |
1 X |
5.0 |
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25 mmol/L MgCl2 |
2.5 mmol/L |
5.0 |
|
10 mmol/L dNTPs |
0.2 mmol/L |
1.0 |
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10 μmol/L 正向引物 |
0.5 μmol/L |
2.5 |
|
10 μmol/L 反向引物 |
0.5 μmol/L |
2.5 |
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5 U/μL Taq 酶 |
0.05 U/μL |
0.5 |
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DNA 模板 |
- |
1.0 |
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超純水 |
- |
32.5 |
|
總體積 |
- |
50.0 |
注：反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)反應(yīng)體系的總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
表3 肉毒梭菌肉毒毒素基因 PCR 檢測的反應(yīng)參數(shù)
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預(yù)變性 |
擴(kuò)增 |
循環(huán)數(shù) |
后延伸 |
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95℃，5 min |
94℃，1 min；
60℃，1 min；
72℃，1 min |
40 |
72℃，1 min |
注：PCR 反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整
其他肉毒桿菌檢測方法簡介：
1、PCR-RFLP（限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)）
PCR-RFLP 的基本原理是用 PCR 擴(kuò)增目的 DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長度的 DNA 片段條帶。
2、16S rRNA 分析
不同種的真細(xì)菌與古細(xì)菌間的 16S rRNA 基因是高度保守的。它常被用于對各種生物物種進(jìn)行研究。
在核酸檢測中，水中的各種污染物尤其是核酸酶對檢測結(jié)果有著非常大的影響。DNase 與 RNase 會降解核酸；酶活性的發(fā)揮需要離子濃度合適的緩沖液，特別是 Mg2+ 對 Taq 酶的活性起到?jīng)Q定性的作用；有機(jī)物會起到非競爭性抑制劑的作用；同時，細(xì)菌會持續(xù)地釋放離子和小分子有機(jī)物，其基因被擴(kuò)增也會對結(jié)果造成影響。
RephiLe 為用戶特別推薦 Direct-Pure UP 超純水一體機(jī)，該純水儀以自來水為進(jìn)水，同時制備反滲透 RO 水和高品質(zhì)的超純水，一機(jī)兩水，以供不同需求客戶的選擇。終端可配置超濾過濾器，有效控制細(xì)菌< 0.1 cfu/ml，熱原< 0.001 Eu/ml，滿足生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)的特別要求。
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