觀察運用電針治療對阿爾茨海默病模型大鼠行為學影響的實驗研究
| 【摘要】 目的 通過針刺的方法治療阿爾茨海默病模型大鼠，觀察對其學習和記憶的改善效果。方法 通過給大鼠灌服D-半乳糖制劑，造成大鼠阿爾茨海默病模型。分別設(shè)立正常對照組、模型對照組、藥物對照組、普通針刺對照組、電針對照組。正常對照組、模型對照組只給予相同劑量的生理鹽水灌服，藥物對照組給予哈伯因混懸液灌服治療，普通針刺組采用針刺“百會”、“神庭”、“腎俞”、“太溪”、“足三里”的方法進行治療，電針組采用針刺“百會”、“神庭”、“腎俞”、“太溪”、“足三里”穴，并在些基礎(chǔ)上聯(lián)接電針進行治療。以10d為1個療程，共治療3個療程。通過大鼠跳臺試驗來檢測大鼠的學習和記憶能力，并對大鼠大腦海馬CAI區(qū)的tau蛋白含量進行觀察。結(jié)果 造模后，正常對照組大鼠的記憶逃避潛伏期時間明顯少于模型對照組(P <0.05)，治療結(jié)束后藥物對照組、普通針刺組、電針組的逃避潛伏時間短于模型對照組(P <0.05)。電針組的療效優(yōu)于普通針刺組和藥物對照組(P <0.05)。而治療后，海馬CAI區(qū)的 P-tau蛋白表達治療組都低于模型組，且電針組的效果要優(yōu)于藥物對照組和普通針刺組(P <0.05)。 【關(guān)鍵詞】 針刺；阿爾茨海默病；記憶能力 隨著年齡的增大，老年人中癡呆的發(fā)生率逐漸增高，其中以阿爾茨海默病(又叫老年性癡呆)最為多見。這是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(大腦)神經(jīng)細胞的脫髓鞘式退變。臨床上主要表現(xiàn)為記憶能力、判斷能力、學習能力以及行動能力、生活自理能力普遍下降，給患者生活質(zhì)量和家庭生活都帶來了不利的影響。而目前尚未有特效藥物和治療方法問世，而中醫(yī)的針灸治療在臨床上卻收到了較為明顯的改善效果。而其中的作用機理卻未被揭示，本文從神經(jīng)行為學和組織化學的層面作了觀察，期望為針刺治療該病的機理提供佐證。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 主要器材：采用由北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司生產(chǎn)的Morris水迷宮，為改良型水迷宮，其跳臺可以定時出現(xiàn)。由日本株式會社生產(chǎn)的B50型天平，由美國Sigma生物技術(shù)有限公司提供的測試AD P-tau蛋白的原位原位雜交試劑盒，中國江蘇華佗醫(yī)療設(shè)備廠出產(chǎn)的“長城牌”電針儀。 1.1.2 主要應(yīng)用試劑：誘發(fā)AD模型所用D-半乳糖由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，藥物對照組所用藥物為河南竹林眾生制藥有限公司生產(chǎn)的哈伯因懸服液。 1.2 動物篩選 將所有購自黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心的Wistar大鼠放入水迷宮中，進行適應(yīng)性的游泳訓練，記錄其游泳距離，學習逃避潛伏期和學習錯誤次數(shù)，訓練1周。然后將游泳能力障礙，學習記憶能力先天不足的大鼠予以淘汰，最后選取符合實驗條件的50只大鼠進入最后實驗程序。 1.3 模型制備方法 將準備造模的大鼠放入相同環(huán)境中進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，保持充足的光線、水分和食物。然后按每只大鼠200mg/kg體重的劑量向齊腹部注射D-半乳糖，1次/d注射，共持續(xù)6周時間。然后將所有造模大鼠編號，按隨機原則分為模型對照組10只、藥物對照組10只、普通針刺治療組10只、電針組10只。取正常大鼠10只作為正常對照組。 1.4 治療方法 治療開始后，正常對照組、模型對照組均給予每日捆綁30min，并灌服與藥物對照組灌服藥物相同量的生理鹽水；藥物對照組則每日灌服哈伯因懸服液2ml(17μg)；普通針刺組則用“華佗牌”30號針灸針針刺大鼠“百會”、“神庭”、“腎俞”、“太溪”、“后三里”穴，得氣后行針2min，留針30min；電針組則在普通針刺組的基礎(chǔ)上加用“長城牌”電針儀，采用疏密波刺激以上穴位，時間30min�！鞍贂毖ㄔ陬^頂正中線中點頭骨中央；“神庭”穴在頭頂正中線前端；“腎俞”穴在后正中線上，于第二腰椎棘突下旁開一寸；“太溪”穴在后肢踝部外側(cè)后方凹陷處；“后三里”在大鼠后肢膝部外側(cè)前下方。所有大鼠治療時間為6周，治療1次/d。 1.5 測試和取材觀察方法 跳臺試驗。morris水迷宮的游泳池中有一塊橡膠平臺，離水面有1cm。將大鼠放入水池中開始記時，當大鼠通過游泳尋找到水下的平臺時記為學習逃避潛伏期。24h后再重復以上試驗，第2次所需時間為記憶逃避潛伏期。以此作為大鼠的學習和記憶能力的反應(yīng)指標。分別在造模前第1周、治療前第7周、治療后第13周3個時間點進行大鼠學習逃避潛伏期、記憶逃避潛伏期的測試。水迷宮試驗結(jié)束后，將大鼠進行麻醉，接著通過腦過量灌注致其死亡。將大鼠頭骨切開取出大鼠組織，放入深度為4%的1/1000 DEPC溶液中保存，再使用多聚甲醛予以固定待檢。將固定的腦組織由額極向枕極順序平均分成五份，取出第2份腦組織放入24℃的水中用酒精進行梯度脫水處理。其順序是70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→100%乙醇一度→100%乙醇二度→100%乙醇三度，然后染色切片并用二甲苯使組織透明。用AD P-tau蛋白原位雜交試劑盒進行tau 蛋白過度磷酸化陽性檢測。細胞中出現(xiàn)的棕黃色顆粒者即為過度磷酸化tau蛋白表達。最后對tau蛋白陽性表達數(shù)進行統(tǒng)計。 1.6 統(tǒng)計學處理 用電子計算機編輯圖像和表格。所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計。計量資料的表示方式為平均數(shù)±標準差，用方差來分析組與組之間的均數(shù)對比，以P <0.05為衡量標準。在對陽性細胞數(shù)的觀察時每個載玻片取3個視野，計取其平均顆粒數(shù)。 2、討論 許多研究都充分地證實，人對空間結(jié)構(gòu)的學習能力和記憶能力更多的建立在大腦組織 中的海馬神經(jīng)元，而阿爾茨海默癥則是對該區(qū)的腦組織造成持續(xù)性的神經(jīng)細胞的退行性改變而使空間學習和記憶能力下降。學習和記憶能力作為癡呆患者智力指標的重要考查要點，具有金指標的指示地位，所以在實驗中我們把大鼠的學習、記憶逃避潛伏期作為觀察指標。以上結(jié)果清楚表明，經(jīng)過腹腔灌服D-半乳糖后，AD模型大鼠的空間學習和記憶能力已經(jīng)是明顯地退化了，說明D-半乳糖的吸收可以造成大鼠大腦細胞退行性改變，tau蛋白等負面物質(zhì)的產(chǎn)生，使大腦功能退化。然而通過針刺后，大鼠在水迷宮的表現(xiàn)令人欣慰，雖然在治療的6周期間，大鼠的腦細胞仍然處于退變狀態(tài)，但潛伏時間并沒有下降得很快，甚至電針組還有所提升。實驗證實，針刺治療能夠和西藥一樣起到改善腦部功能的作用。經(jīng)過治療，大鼠在學習和記憶能力都較治療前有回升。當然，由于AD不僅是功能，也有一部分器質(zhì)上的改變，所以針刺只能在一定范圍內(nèi)起到治療恢復的作用，而不能使AD大鼠的記憶功能完全恢復；但是實驗也顯示，針刺配合電針相對于普通針刺更有效果，說明如果對針刺手法和方式進行改進，能夠進一步擴大療效，使治療后效果無限接近于正常。從生物化學層面分析，tau蛋白過量產(chǎn)生，對腦功能是一種負面影響，而西藥組和針刺組都不同程度的達到抑制該蛋白產(chǎn)生的目的。而電針更是有效地降低了tau蛋白的表達率，一則說明了tau的確對大鼠記憶系統(tǒng)造成紊亂，另一方面也提示如果能降低tau蛋白的表達，那么就能一定程度地改善大腦功能。 |
來源：北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司
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