冰片對長時連續(xù)作業(yè)大鼠覺醒能力及認知功能的影響
| 摘要 目的: 探討冰片對長時連續(xù)作業(yè)大鼠覺醒能力和認知功能損害的干預作用。方法: 首先采取跑臺作業(yè)方法建立大鼠長時連續(xù)作業(yè)模型, 將模型大鼠分為跑臺冰片組和跑臺對照組, 另設未跑臺對照組。隨后觀察冰片對長時連續(xù)作業(yè)大鼠活動- 靜止行為、 覺醒時間以及穿梭箱主動回避反應的影響。 結(jié)果: 3 組納入測試的大鼠各為 6 只。 結(jié)果顯示給予 0.4 g /kg 冰片(經(jīng)胃灌飼)可增加大鼠長時連續(xù)作業(yè)后的自主活動量(每分鐘活動次數(shù)未跑臺對照組為 54.1± 5.4, 跑臺對照組為 15.5± 8.3, 跑臺冰片組為 26.8± 7.8, 3 組之間兩兩比較, P 均<0.05)和覺醒時間(未跑臺對照組為 639 min± 46 min, 跑臺對照組為 411 min± 36 min,跑臺冰片組為 501 min± 52 min, 3 組之間兩兩比較, P 均<0.05) , 同時還可改善長時連續(xù)作業(yè)大鼠的認知功能(穿梭箱主動回避作為測試反應時間, 未跑臺對照組為 5.63 s± 1.01 s, 跑臺對照組為 6.85 s± 1.24 s, 跑臺冰片組為 6.26 s± 0.96 s, 3 組之間兩兩比較, P 均<0.05)。結(jié)論: 冰片可在一定程度上逆轉(zhuǎn)長時連續(xù)作業(yè)對大鼠覺醒能力和認知功能的損害作用。 關鍵詞 冰片;大鼠長時連續(xù)作業(yè);覺醒能力;認知功能 長時連續(xù)作業(yè)對覺醒能力和認知功能有顯著的損害作用。當前，這一問題的研究已逐漸引起國內(nèi)外的廣泛重視 [ 1,2]。迄今已研發(fā)和篩選出多種抗疲勞藥物及神經(jīng)興奮劑，包括咖啡茵、可可堿、***（安非他明）和莫達非尼等。盡管這些藥物早已得到應用，但其成癮性和選擇性差等缺點在很大程度上限制了其廣泛使用。因此，尋找速效、后效應小以及成癮性小、高選擇性的精神興奮劑必然會成為今后研究的重點[ 3,4]。中醫(yī)藥作為祖國醫(yī)學寶庫，在篩選理想的精神興奮藥物方面有著廣闊的前景，例如牛黃、冰片、麝香、石菖蒲以及蘇合香等芳香開竅藥在臨床實踐中已有大量的應用[ 5,6]。冰片（又稱龍腦）為常用芳香開竅中藥之一，系龍腦香科植物龍腦香樹脂的加工品，或樟腦、松節(jié)油等經(jīng)化學合成加工制成品。天然冰片主要化學成分為龍腦，尚含有大量龍腦的差向異構體異龍腦。中醫(yī)認為冰片味辛苦、微寒、歸心、脾、肺經(jīng)，有開竅醒神、通諸竅等作用。對冰片的藥效學、藥代動力學及安全性等方面的研究表明，冰片除具有抗炎、抗菌、抗生育以及止痛等作用外，還可以縮短戊巴比妥鈉持續(xù)睡眠時間，表現(xiàn)出醒腦和興奮作用[ 7]；而且冰片還能延長小鼠耐缺氧存活時間[ 8]。另外，含有冰片的一些方劑，如安宮牛黃丸和復方丹參片等，已廣泛用于神經(jīng)內(nèi)科，對于治療昏迷、改善老年性癡呆患者的認知功能有明顯療效[ 9～11]。綜上所述，我們有理由推測，冰片可能具有改善長時連續(xù)作業(yè)工作狀態(tài)，以實現(xiàn)提升覺醒能力和認知功能的作用。為了探明冰片是否具有逆轉(zhuǎn)或防治長時連續(xù)作業(yè)不利因素的作用，我們建立了長時連續(xù)作業(yè)大鼠模型，觀察連續(xù)作業(yè)結(jié)束后給予冰片對大鼠隨后 12 h 覺醒能力和認知功能的影響。 1 材料和方法 1.1 主要試劑和儀器 戊巴比妥，天然冰片，液體石蠟；實驗前取適量冰片結(jié)晶體，研缽研細，用液體石蠟配成 8%冰片石蠟油混懸液。分析天平，立體定向儀，多道生理信號采集處理系統(tǒng)，小動物跑臺，穿梭箱主動回避行為測試裝置，視頻監(jiān)視器，視頻捕捉及分析軟件。 1.2 實驗動物及分組 健康成年雄性SPF級SD大鼠，體重( 250±10)g。所有大鼠均在設定的室內(nèi)環(huán)境中至少適應 2周。室內(nèi)環(huán)境：明-暗周期 12 h: 12 h（7: 00 開始給予光照），自然光照，溫度 24~26 ℃。動物自由飲水、攝食。實驗共分為 3 組，各組 6 只大鼠：①未跑臺對照組：不進行跑臺作業(yè)，置于鼠籠中自由活動，進食、飲水時間及其他處理因素與作業(yè)組一致；②跑臺冰片組：進行長時連續(xù)跑臺作業(yè)，作業(yè)結(jié)束后給予 0. 4 g/ kg冰片石蠟油溶液；③跑臺石蠟油組：在進行長時連續(xù)跑臺作業(yè)結(jié)束后給予與跑臺冰片組同體積的石蠟油溶液。 1.3 腦電電極安放及皮層腦電( electrocorticogram,ECOG)記錄具體方法參照以往文獻[ 12]進行。戊巴比妥鈉麻醉（30 m g/ kg，腹腔注射）后，大鼠頭部固定于立體定向儀框架上。將銅質(zhì)螺絲釘分別通過顱骨埋入額葉和頂葉皮層，以接觸到硬腦膜為度，用于記錄皮層腦電活動。腦電極以牙科水泥固定于顱骨上。手術結(jié)束后，動物在上述室內(nèi)環(huán)境中恢復 2 周。采用 R M 6240 多道生理信號采集處理系統(tǒng)進行腦電記錄。 1.4 長時連續(xù)作業(yè)方法 長時連續(xù)作業(yè)在小動物跑臺上進行，采用我們已建立的（18+6 h）×2 作業(yè)模式[ 12]。作業(yè)過程包括 20 m i n 作業(yè) +20 m i n 作業(yè)暫停，作業(yè)和作業(yè)暫停視為 1 個周期。跑臺參數(shù)設定：作業(yè)時坡度0°，速度 15 m / m i n；作業(yè)暫停時坡度 0°，速度 7m / m i n。作業(yè)暫停過程中，跑臺速度較為緩慢，由于跑道長約 1 m ，則動物每次最多可有 9 s的運動暫停時間，此時運動因素影響作用降到最低，而只是達到睡眠剝奪的目的，因此我們把此過程稱為作業(yè)暫停。整個過程連續(xù)給予電刺激，刺激強度20 V，頻率 60 H z，一旦動物進入電刺激區(qū)則會受到電擊，迫使其繼續(xù)運動。每 4 個周期后將動物置于籠中給予自由活動，自由攝食、飲水 15m i n。作業(yè)前所有動物均未進行過跑臺適應訓練。本實驗采用連續(xù) 48 h（兩個晝夜周期）作業(yè)模式，每個晝夜周期包括作業(yè)階段和休息階段兩個部分。（1）跑臺作業(yè)階段： 第 1 天19: 00至第 2 天13: 00，進行跑臺作業(yè)訓練；（2）休息階段：第 2 天13: 00～ 19: 00，大鼠在鼠籠中自由活動，自由攝食、飲水。 1.5 給藥方法 參照文獻劑量[ 9]， 冰片所用劑量為 0. 4 g /kg，通過自制的灌胃管給藥。給藥均在跑臺作業(yè)結(jié)束（13: 00） 后 5. 5 h （18: 30）進行，在 30 m i n內(nèi)完成。 1.6 覺醒能力及認知功能評價 通過 3 項指標來評價動物的覺醒能力和認知功能，即大鼠覺醒期間（19: 00～ 7: 00）的行為狀態(tài)分布模式、覺醒時間以及穿梭箱主動回避行為測試。 1.7 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計 計量資料以 x± s 表示，采用 SPSS10. 0 軟件進行單因素方差分析（A N O V A） 。 2 結(jié)果 2.1 冰片對長時連續(xù)作業(yè)大鼠活動- 靜止行為活動分布的影響本實驗通過視頻監(jiān)視器對大鼠自主活動進行連續(xù)觀察和記錄，記錄結(jié)果通過視頻分析系統(tǒng)（R M V I D EO）進行分析，該系統(tǒng)把大鼠自主活動簡化為活動和靜止兩種狀態(tài)，自主活動量以平均每分鐘的活動次數(shù)計算。結(jié)果如表 1 所示，未跑臺對照組在整個夜間（19: 00- 7: 00）主要處于活動狀態(tài)；跑臺冰片組活動明顯多于跑臺石蠟油組（P<0. 05） ，但仍比未跑臺對照組少（P <0. 01）2.2 冰片對長時連續(xù)作業(yè)大鼠覺醒時間的影響動物的睡眠、覺醒狀態(tài)主要通過 EC O G 進行判斷： δ波（0. 25～ 4 H z）通�？勺鳛槁ㄋ叩呐卸ㄖ笜薣13]。覺醒時間測試結(jié)果：未跑臺對照組為（639± 46）m i n，跑臺石蠟油組為（411± 36）m i n，跑臺冰片組為（501± 52）m i n；3 組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0. 05） 。 2.3 冰片對長時連續(xù)作業(yè)大鼠穿梭箱主動回避反應的影響給藥后 3 組大鼠分別進行穿梭箱主動回避行為測試，測試均在 21: 00 進行。各組大鼠反應時間：未跑臺對照組為（5. 63 ± 1. 01）s， 跑臺石蠟組為（6. 85 ±1. 24）s，跑臺冰片組為（6. 26 ±0. 96）s；3 組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義 （P <0. 05） 。 3 討論 長時連續(xù)作業(yè)對機體各個系統(tǒng)以及各種正常功能產(chǎn)生復雜影響，主要表現(xiàn)為覺醒能力的下降（即覺醒不良，ar ousaldef i ci t）和認知功能的受損[13～ 16]，即工作狀態(tài)受損。因此，目前對長時連續(xù)作業(yè)不利影響防護措施的研究主要是集中于探索改善覺醒狀態(tài)與恢復認知功能。大量文獻已經(jīng)表明，目前作業(yè)過程中作業(yè)能力下降的防治措施主要包括兩方面：非藥物干預和藥物干預[2～5]。中醫(yī)認為芳香開竅藥（如牛黃、冰片、麝香、石菖蒲以及蘇合香等）具有通關開竅、啟閉醒神的作用，用于治療閉證�，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，某些芳香開竅藥具有興奮神經(jīng)系統(tǒng)，改善工作狀態(tài)以及減少睡眠等作用[6～11]。例如，小劑量麝香可縮短異戊巴比妥鈉誘導的睡眠時間；麝香水劑給清醒兔靜脈注射，首先引起大腦皮層興奮，表現(xiàn)為腦電去同步化，隨后腦電出現(xiàn)高壓復合波群，但行為上一直保持警惕狀態(tài)，毫無困倦和睡眠傾向，并未出現(xiàn)痙攣、抽搐[17, 18]。又如，安宮牛黃丸可以廣泛促進 c- f os基因在腦干、丘腦以及皮層相關覺醒腦區(qū)的表達，提示該藥可能通過激活這些腦區(qū)從而達到促進清醒的作用[19]。文獻中對單味冰片的醒腦和興奮作用已有報道[9]。在此基礎上，我們觀察了冰片對長時連續(xù)作業(yè)大鼠覺醒能力及認知功能的影響。實驗中，我們首先通過跑臺作業(yè)方式建立連續(xù)作業(yè)大鼠模型，在作業(yè)過程結(jié)束后灌胃給予適量冰片，結(jié)果顯示，冰片在一定程度上可以恢復長時連續(xù)作業(yè)大鼠的活動能力，增加覺醒時間，同時對認知功能也有改善作用。需要說明的是，本實驗中的冰片給藥劑量（0. 4 g/ kg）依據(jù)了既往報道[9]，該文獻中所用實驗動物為小鼠，而本實驗中采用的是大鼠，但二者的結(jié)論是一致的，即冰片在該劑量下具有明顯的促覺醒效應。另一方面，有文獻證實，冰片可以改變下丘腦去甲腎上腺素、多巴胺、組胺以及 5- 羥色胺的含量[20]，而下丘腦的這些遞質(zhì)又與機體覺醒狀態(tài)的發(fā)生和維持密切相關，因此我們推測，冰片對長時連續(xù)作業(yè)大鼠覺醒能力和認知功能的影響可能涉及上述遞質(zhì)水平的變化。這一推測是否成立還需要實驗證明。盡管我們的研究初步揭示了冰片對長時連續(xù)作業(yè)的不利影響可起到一定的干預作用，但其作用機理以及冰片的藥代動力學、藥效學和副反應等問題還需要更多的實驗探明。此外，其他芳香開竅藥是否同樣可以對長時連續(xù)作業(yè)所引起的不利影響產(chǎn)生干預作用，亦有待進一步研究。 |
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