帕金森病動物模型制備

為模擬人類PD，理想的動物模型應具備以下一些特點： (1)多巴胺能神經(jīng)元在出生時數(shù)量及形態(tài)正常，青年時期開始逐漸選擇性地減少，減少量超過50％，且容易通過神經(jīng)化學和神經(jīng)生理學的方法檢測到； (2)模型應能容易檢測其運動功能的損傷，包括運動遲緩、肌僵直和靜止性震顫等PD的主要癥狀； (3)模型應能顯示出路易小體的形成；(4)如果模型是遺傳性的，應基于單一突變而使突變模型有著強大的傳播能力； (5)模型應有相對較短的疾病周期(如數(shù)月)，以使藥物篩選得以經(jīng)濟、快速地進行。

國際通用國內應用較多是兩種方法：①通過在大鼠的黑質或內側前腦束注射6羥多巴胺（6-OHDA）②通過對模型動物(如:猴、小鼠、豬等)進行1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTR）的管飼法和立體定位注射等方法。前者是較精典的模型制備的方法，也是在國內較早開展的，但是其存在①神經(jīng)元的毀損出現(xiàn)的較早，這與臨床PD病人的中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元的漸進性死亡不同②近距離的毀損很難把握毀損的程度，這使得采用這種方法獲取部分損毀的模型的成功率很低；較之前者采用MPTP管飼法和立體定位注射方法，在國內最近幾年才運用到帕金森動物模型的制備，國外已經(jīng)利用MPTR在猴和小鼠身上建立了較為理想的PD模型，制備通常采用皮下、靜脈、腹腔注射和肌肉給藥，具有方法可靠且重復性較好。但是其危險性較高，對于試驗人員和試驗條件有著嚴格的要求。

1、模型鼠制備

1968年Ungenstdet首先報道采用6—經(jīng)多巴胺(6-OHDA)在大白鼠造成帕金森病動物模型．該動物旋轉模型的某些特點和人類賊金森病相似。近來，人們根據(jù)6—OHDA的注射部位及注射劑量不同，來造成模擬不同階段帕金森病的動物模型。

注射6-OHDA來制備帕金森病鼠的步驟：

1）實驗選擇體重250~300g健康雄性Wistar大鼠36只來制備帕金森氏病的大鼠模型

2）大鼠用戊巴比妥（48mg/kg）腹腔注射注射麻醉

3）解剖操作 將麻醉后的大鼠固定于江灣I型C立體定向儀上，頭部正中切口，剝離骨膜，止血。參照George圖譜，用牙科鉆在顱骨頂鉆孔，定位坐標為：門齒與耳桿平行，前囪后3mm，旁開3.0mm，顱骨表面下9.0mm，將自制同心套管插入右側NS區(qū)(套管外徑0.7mm，內管外徑0.4mm，內管比外管前端1.5mm,用502膠和自凝牙托粉固定。

4) 微量注射器吸6-OHDA溶液4μL(含9.0μg 6-OHDA和8.8μg抗壞血酸)，速度為1μg／min，注射后留置4min退出，縫合皮膚。

5) 21天參照參照Francois的實驗方法 (包括行動遲緩實驗、抓握實驗和尾強直實驗記錄強直癥狀的變化、震顫實驗)記錄帕金森氏病的三大癥狀．并記錄肌電圖變化，以鑒別大鼠模型建立是否成功。判斷標準如下：①出現(xiàn)行動遲緩實驗持續(xù)35min②抓握實驗持續(xù)55 min、尾強直實驗持續(xù)30min③震顫頻率在48次／min以上和肌電圖群放電位頻率在4-8次／s。

2、應用6-OHDA制備偏側PD鼠模型

1) 雄性Sprague-Dawley大鼠，體重230一250g

2) 實驗動物經(jīng)戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉后，固定于立體定向儀(江灣I型C)上。

3) 參照大鼠腦立體定位圖譜,取兩個靶點a點:前囟尾側5.0mm，中線右側1.9mm,硬腦膜腹側7.4mm；b點：前囟尾側5．3mm，中線右側2.5mm,硬腦膜腹側6.5mm)。將12μg 6-OHDA(Sigma公司)立體定向注射于右側黑質a、b兩個靶點(每點注射量6μg，濃度2μg／μl，溶解于含0.1%抗壞血酸的生理鹽水中)。注射速度0.3μl／min．注畢留針15min。

4) 行為檢測 模型建立3周后，用阿樸嗎啡(apomnphine，APO)按0.25mg／kg誘發(fā)大鼠向左側(未損傷側)旋轉，記錄半小時內旋轉次數(shù)，選210轉／30min(7轉／min)以上的動物為成功PD模型

應用1-甲基-4-苯基－1,2,3,6四氫吡啶制備PD動物模型

3、靈長類PD模型

恒河猴在戊巴比妥(40mg／kg)腹腔麻醉下，切開頸部皮膚，經(jīng)鈍性分離暴露一側頸總動脈。對動物行頸總動脈注射，即將新鮮配制的MPTP(Sigma)按1.0—1.5mg／kg體重溶于2mL生理鹽水中，逆血流方向緩慢注入血管中。若動物在第1次手術后PD癥狀不明顯，故分別在每隔5d后又給予第2—4次注射，直至PD癥狀出現(xiàn)。用MPTP建立的靈長類雙側及偏側PD模型，在癥狀、體證、病理、生化、對藥物治療的反應方面與人類PD的特征極為相似，被認為是最具代表性的PD動物模型。

4、MPTP用于帕金森病小鼠模型制作

小鼠對MPTP的敏感性存在種系和年齡的差異。一般選10~12周齡，體重25~30g成年C57BL褐鼠，按體重30~40 mg／kg腹腔注射MPTP，連續(xù)7d。于第6~7次注射后出現(xiàn)暫時性(2~3h)軀干震額、豎毛、尾巴過伸、動作減少及爬桿試驗障礙。

5、MPTP用于舶金森病小國模型制作時的一些注意

C57BL小鼠對MPTP最為敏感，而CF-W小鼠、FVB／N小鼠和Balb/C小鼠對MPTP的敏感性較C57BL小鼠稍差，CF-1和CD-1對MPTP的敏感性最差。目前較常用的小鼠為C57BL/6小鼠

b)  鼠齡對MPTP敏感性的影響

老齡鼠較青年鼠對MFTP更為敏感，這種敏感性的差異不僅表現(xiàn)在順處理后的老齡鼠能夠呈現(xiàn)更為明顯的黑質多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目的減少，而且還能在順處理后的老齡鼠身上觀察到藍斑區(qū)腎上腺紊能神經(jīng)元數(shù)目的減少以及較典型的帕金森病行為學方面的改變

6、帕金森病小鼠模型行為學改變的定量觀察

1）  爬桿試驗

2）  懸掛實驗

3）  游泳實驗

以上幾種定量觀察法為帕金森病小鼠模型行為學的研究提供了一些較為準確和客觀的方法，同時也提高了整個實驗的客觀性。

7、其他建立模型的方法

1）利血平模型 利血乎主要可以通過抑制去甲腎上腺素能神經(jīng)元末梢的再攝取功能，使囊泡內貯存的多巴胺(DA)及其他的兒茶酚胺類遞質耗竭。將雄性Wistar大鼠(體重280—300g)腹腔內注射一定劑量的利血平后可使其出現(xiàn)骨傷肌慢硬、震顫、身體屈曲、運動過少以及其他的一些運動癥狀。神經(jīng)化學分析發(fā)現(xiàn)大鼠紋狀體內DA和其他單胺類遞質的含量明顯減少。因此．這類模型在一定程度上模擬了PD的臨床表現(xiàn)和神經(jīng)化學改變。但它存在明顯的不足：一是藥物注射造成的運動障礙在不同時間和不同個體之間變異性較大；二是利血乎同時引起了多種遞質釋放并且無法造成類似PD的病理改變。因此該模型的應用只局限于探索藥物影響肌僵狀態(tài)的實驗中，對其他的運動癥狀的研究現(xiàn)已很少應用。

2）Fe³⁺模型 1991年Ben-Shachar在雄性SD大鼠(250~300g)單側黑質內注射Fe³⁺三周后可使其出現(xiàn)明顯的運動行為改變，表現(xiàn)為在新環(huán)境中自主運動減少，短暫的僵直癥狀及自發(fā)的同測旋轉行為。安菲它明(AMPH)可使這種同測旋轉行為加強。神經(jīng)化學研究發(fā)現(xiàn)同側紋狀體DA含量平均減少95％，并且其代謝產(chǎn)物3，4—二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的含量也明顯減低。組織病理學證實酪氨酸經(jīng)化酶(TH)免疫染色陽性細胞大量減少，同時膠質細胞增生活躍。

3）機械損傷模型 研究發(fā)現(xiàn)機械損傷內側前肋束(MF可以造成黑質內的DA能神經(jīng)元進行性死亡。已經(jīng)建立的造模方法有MFB獨突切斷術和中腦半切術，尤以前者應用較多。MFB切斷術損傷模型的建立需要在大鼠腦立體定位儀上準確定住后，用特制的Scouten電線刀深入到MFB所在的部位將其切斷。Brechne用此方法切斷雄性CFHB大鼠(150～180g)的MFB后，分別于第1，2，4，6，10，16周計數(shù)DA能神經(jīng)元的存活數(shù)目，發(fā)現(xiàn)約28％的黑質(SN)神經(jīng)元在一周左右死亡，10周后約70％的細胞死亡。平均SN神經(jīng)元存活數(shù)是29％。逆行追蹤顯示MFB切斷成功率為92％～99％。可見，用該方法造模有如下優(yōu)點：①成功率高，較為經(jīng)濟。②黑質DA能神經(jīng)元呈現(xiàn)漸進性死亡，可以模擬PD病理變化的全過程，對于研究神經(jīng)元的再生和PD的預防有一定的意義。缺點是切斷術后短時間內，損傷的程度不穩(wěn)定。