腦力智寶對實驗性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

【摘要】  目的研究腦力智寶對實驗性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法結(jié)扎實驗大鼠雙側(cè)頸總動脈制作腦缺血模型，Morris水迷宮法測試其學(xué)習(xí)記憶功能，HE染色法觀察其神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞。結(jié)果腦力智寶能顯著縮短實驗性腦缺血大鼠的逃避潛伏期，增加跨越原平臺位置的次數(shù)；顯著減少頂葉皮層及海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)論腦力智寶對腦缺血損傷所致學(xué)習(xí)記憶功能減退具有改善作用，可能與其能減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】  腦力智寶 腦缺血 學(xué)習(xí)記憶 細(xì)胞凋亡

  腦力智寶用于治療精神發(fā)育遲滯、腦癱、腦血管病后遺癥、腦外傷后遺癥、腦炎后遺癥、老年性癡呆等腦病伴發(fā)的智力和肢體功能障礙，具有一定的療效。臨床研究表明腦力智寶能明顯改善腦梗塞后遺癥患者運動、語言及精神方面的癥狀。離體細(xì)胞研究表明腦力智寶及其含藥血清可能通過促進Bcl-2蛋白的表達、增加細(xì)胞膜流動性等途徑對硝普鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有保護作用。本實驗觀察了腦力智寶對實驗性腦缺血損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶功能與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，旨在闡明腦力智寶用于治療腦缺血損傷性疾病后遺癥的機理。

    1  材料與方法

    1.1  動物  健康Wistar大鼠，體重220～250 g，雌雄各半，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

    1.2  藥物與儀器  腦力智寶由廣東高明腦病醫(yī)療醫(yī)藥研究院提供，制備成1 g生藥/ml供試液，灌胃前按所需濃度稀釋。尼膜同（尼莫地平，nimodipine, Nim）片劑，德國拜耳公司產(chǎn)品，批號CAGFT3。TUNEL法凋亡細(xì)胞檢測盒，德國寶靈曼公司（BOEHRINGER MANNHEIM）產(chǎn)品，Morris水迷宮（SuperMaze動物行為學(xué)分析系統(tǒng)）由上海欣軟信息科技有限公司提供。

    1.3  腦缺血損傷致學(xué)習(xí)記憶障礙模型的制備大鼠經(jīng)10%烏拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，行頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，用絲線結(jié)扎，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠同法分離雙側(cè)頸總動脈，但不結(jié)扎。

    1.4  分組與給藥  將造模成功動物隨機分為4組：模型組、尼莫地平組、腦力智寶小劑量組與腦力智寶大劑量組，每組8只，雌雄各半。假手術(shù)組大鼠8只，雌雄各半。待大鼠蘇醒后，尼莫地平組按12 mg/kg灌胃給予尼莫地平混懸液；腦力智寶不同劑量組分別按小劑量4 g/kg、大劑量8 g/kg灌胃給予腦力智寶供試液；假手術(shù)組和模型組分別給予等容量生理鹽水，1次/d，連續(xù)30 d。

    1.5  Morris水迷宮測試  各組大鼠在藥物干預(yù)結(jié)束后開始水迷宮測試。水迷宮由直徑130 cm，高50 cm圓形水池組成，水深30 cm，水溫（26±1）℃，在水池壁標(biāo)明4個入水點，由此將水池分為4個象限，任選一象限，正中放一個直徑12 cm，高29  cm的平臺，沒于水下1 cm，水面覆蓋泡沫塑料。測試包括：①定位航行實驗：歷時6 d，分別從4個不同的標(biāo)記入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄在120 s內(nèi)尋找平臺所需的時間（逃避潛伏期）。若大鼠入水后120 s內(nèi)未能找到平臺，則將其置于平臺上并停留15 s，逃避潛伏期記錄為120 s。②空間探索實驗：定位航行實驗結(jié)束后，撤除平臺，任選一個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)。

    1.6  腦組織形態(tài)學(xué)觀察  將進行學(xué)習(xí)記憶能力測試后的大鼠麻醉下處死，快速斷頭取腦，浸泡于10%中性甲醛液中固定。切片進行HE染色，光鏡下觀察拍片。普通光鏡400×倍下計數(shù)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層500 μm范圍內(nèi)核完整椎體細(xì)胞數(shù)目與頂葉皮層每個視野下核完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目，每張切片計數(shù)5個不重疊視野。

    1.7  原位細(xì)胞凋亡檢測  切片經(jīng)脫蠟、水洗、蛋白酶K消化、TUNEL反應(yīng)，按試劑盒指示常規(guī)操作。光鏡下觀察拍片，普通光鏡400×下計數(shù)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層500 μm長范圍內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)目與頂葉皮層每高倍視野下凋亡細(xì)胞數(shù)目，每張切片計數(shù)5個不重疊視野。

    1.8  統(tǒng)計學(xué)處理  實驗數(shù)據(jù)用±s表示，運用統(tǒng)計軟件SPSS11.0 for windows 11.5 進行重復(fù)測量方差分析與單因素方差分析。

    2  結(jié)果

    2.1  定位航行實驗結(jié)果  在定位航行實驗中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組大鼠的平均逃避潛伏期總體呈逐漸下降趨勢，但下降的速率不一致，各組大鼠平均逃避潛伏期的比較見圖1。第1，4，5，6天，模型組平均逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長（P<0.01）。與模型組比較，尼莫地平組第5，6天平均逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01），腦力智寶小劑量組第1，4，5，6天平均逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05或 P<0.01），腦力智寶大劑量組第1，2，4，5，6天平均逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01），而與假手術(shù)組比較差異無顯著性（P>0.05）。

    圖1  各組大鼠平均逃避潛伏期比較

    2.2  空間探索實驗結(jié)果  在第7天的空間探索試驗中，模型組大鼠多在平臺所在的象限外游泳，而其他組大鼠運動軌跡多位于原平臺所在象限，各組大鼠跨越原平臺位置的次數(shù)比較見表1 。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠跨越原平臺位置次數(shù)明顯減少( P<0.01) ；尼莫地平組、腦力智寶小劑量組和大劑量組大鼠跨越原平臺位置次數(shù)較模型組明顯增加(P<0.01)。表1  各組大鼠在空間探索試驗中跨越原平臺位置的次數(shù)

    2.3  腦組織形態(tài)學(xué)觀察  模型組大鼠大量神經(jīng)細(xì)胞壞死或嚴(yán)重皺縮，體積變小，胞核與胞漿界限不清，血管、神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞周圍間隙擴大。各給藥組大鼠壞死神經(jīng)細(xì)胞顯著減少，零星可見一些損傷細(xì)胞，海馬椎體細(xì)胞層細(xì)胞形態(tài)、排列基本正常。見圖2～9。各組大鼠頂葉皮層與海馬CA1區(qū)核完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量比較結(jié)果見表2。與假手術(shù)組比較，模型組頂葉皮層與海馬CA1區(qū)核完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.01）；與模型組比較，尼莫地平、腦力智寶小劑量與大劑量均能顯著改善不完全腦缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞壞死與丟失（P<0.05或P<0.01）。

    2.4  TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞結(jié)果  不完全腦缺血損傷30 d后，腦組織中已有大量凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色，陰性細(xì)胞為淡藍色。凋亡細(xì)胞有的呈散在分布，也有呈灶狀分布，可能系壞死灶。各組大鼠頂葉皮層與海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量比較結(jié)果見表3。與模型組比較，尼莫地平、腦力智寶小劑量與大劑量均能顯著減少不完全腦缺血損傷后頂葉皮層及海馬CA1區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)量（P<0.05或P<0.01）。表2  各組大鼠頂葉皮層與海馬CA1核完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的比較 各組大鼠頂葉皮層與海馬CA1凋亡細(xì)胞數(shù)量的比較

    3  討論

    大鼠雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎能造成學(xué)習(xí)記憶障礙，是一種簡便易得、比較理想的研究腦缺血后神經(jīng)損傷及智能障礙的動物模型。腦缺血后以神經(jīng)元為主的細(xì)胞凋亡是缺血性腦損傷中重要的病理生理過程，其特點是主要分布在腦梗塞的邊緣區(qū)域，多為遲發(fā)性，干預(yù)缺血后凋亡過程有助于治療腦缺血性損傷。

    腦力智寶主要由當(dāng)歸、紅花、遠志、石菖蒲、黃精、益智仁、龜甲、枸杞子、核桃仁等組成。方中當(dāng)歸、紅花養(yǎng)血活血，破淤散結(jié)；石菖蒲、遠志化痰開竅；黃精、益智仁益氣健脾；龜甲、枸杞子、核桃仁平補腎陰腎陽，益髓填精�，F(xiàn)代藥理研究資料表明，當(dāng)歸能抑制Bax蛋白的表達，減少腦缺血區(qū)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；紅花可以減少腦梗塞體積，在腦缺血損傷急性期可增加神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白bcl-2的表達而減少Caspase-3的表達；遠志、黃精、益智仁能夠改善學(xué)習(xí)記憶功能；石菖蒲可通過增強突觸可塑性，改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，石菖蒲揮發(fā)油可以有效抑制腦缺血-再灌注后興奮性氨基酸Glu、Asp、GABA含量的異常升高，抑制大鼠腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞Bax基因表達，增強Bcl-X基因的表達，從而抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

    本研究表明在雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎致腦缺血損傷30 d后，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退，大量神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡。經(jīng)腦力智寶治療的腦缺血損傷大鼠則學(xué)習(xí)記憶功能顯著改善，凋亡細(xì)胞顯著減少。既往研究表明腦力智寶可以通過抗氧化作用、Ca2+拮抗作用、促進Bcl-2蛋白的表達和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動性，從而抑制NO誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。因此，腦力智寶拮抗腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機制可能與其抑制興奮性氨基酸與NO的神經(jīng)毒性作用、調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達有關(guān)。減輕腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可能是腦力智寶改善腦缺血損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的機制之一。本研究為腦力智寶用于治療腦缺血損傷性疾病后遺癥提供了實驗依據(jù)。