快速、同時分離九種脂溶性維生素的單次進(jìn)樣超高效合相色譜方法

Rui Chen、Jinchuan Yang和John McCauley

沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德)

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同時分離九種脂溶性維生素及胡蘿卜素，可避免使用多種HPLC方法，并且可減少在對膳食補(bǔ)充劑和營養(yǎng)強(qiáng)化食品中的脂溶性維生素進(jìn)行定性與定量分析時所需要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)步驟�？焖俜蛛x疏水性維生素及胡蘿卜素可顯著提升樣品通量以及減少實(shí)驗(yàn)花費(fèi)，因而可滿足日益增加的法規(guī)依從性需求，以監(jiān)測大量的分析工作。

 

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配備光電二極管陣列(PDA)檢測器的ACQUITY UPC²™系統(tǒng)

Empower^® 3軟件

ACQUITY UPLC^® HSS C₁₈色譜柱

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維生素、胡蘿卜素、脂溶性、維生素A乙酸鹽、維生素A棕櫚酸鹽、維生素D2、α-生育酚、維生素E乙酸鹽、維生素K1、維生素K2、番茄紅素、β-胡蘿卜素、合相色譜分離術(shù)、UPC²

 

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脂溶性維生素(FSV)包括維生素A、D、E、K及類胡蘿卜素(例如β-胡蘿卜素)。脂溶性維生素參與許多與重要生理功能相關(guān)的復(fù)雜代謝反應(yīng)，例如視力(維生素A)、鈣吸收(維生素D)、細(xì)胞膜的抗氧化(維生素E)、及血液凝固(維生素K)。¹β-胡蘿卜素是維生素A的前體，且在人體內(nèi)具有100%維生素A活性。番茄紅素不是人體的必需營養(yǎng)素，但它的抗氧化性能使它廣受歡迎，越來越多地與其他成分一起被添加到某些膳食補(bǔ)充劑中。幾種脂溶性維生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

維生素及營養(yǎng)補(bǔ)充劑是一個價值幾十億的市場。預(yù)計(jì)在未來的五到十年，這一市場仍將繼續(xù)增長。²這是由于全世界的消費(fèi)者越來越追求更好以及更健康的生活方式，以及越來越注重健康以及飲食習(xí)慣。然而，人們也越來越關(guān)注從營養(yǎng)補(bǔ)充劑以及營養(yǎng)強(qiáng)化食品中所攝取的脂溶性維生素的安全性問題，特別是維生素A及D，若過量食用，也會帶來嚴(yán)重的健康風(fēng)險。³由于在許多國家，許多針對營養(yǎng)強(qiáng)化食品及膳食補(bǔ)充劑中所添加微量元素的合規(guī)性的法律正在擬定或制定中，因此，市場上必然對能夠快速、準(zhǔn)確地分析不同產(chǎn)品中的脂溶性維生素含量的分析方法有更高的需求。

目前，在進(jìn)行FSV分離時，最常使用的是液相色譜(LC)方法，反向(RP)與正向(NP)方法均有。^1,3-5雖然有AOAC法可用于對食品及營養(yǎng)補(bǔ)充劑當(dāng)中的各種脂溶性維生素分別進(jìn)行定性與定量分析，但卻缺少一種可對維生素預(yù)混物中的脂溶性維生素以及類胡蘿卜素同時進(jìn)行分析的方法。³

 

由于超高效合相色譜(UPC²™)分離速度快、經(jīng)濟(jì)耐用，因此可考慮將其用于對含有多種脂溶性維生素的藥物制劑進(jìn)行快速分析。⁶在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們闡述了一種單次進(jìn)樣方法，它可在四分鐘時間內(nèi)同時分離九種脂溶性維生素。優(yōu)化后的方法在保留時間以及峰面積方面具有良好的重現(xiàn)性，且可用于進(jìn)行高通量定量分析。

 

 

 

七種脂溶性維生素：視黃醇乙酸鹽(維生素A乙酸鹽)、視黃醇棕櫚酸鹽(維生素A棕櫚酸鹽)、α-生育酚(維生素E)、α-生育酚乙酸鹽(維生素E乙酸鹽)、麥角骨化醇(維生素D2)、維生素K1、維生素K2 (MK-4)；及兩種胡蘿卜素：番茄紅素及β-胡蘿卜素均購自西格瑪公司(Sigma Aldrich)，并且未經(jīng)處理直接使用。將所有樣品以約0.1 mg/mL的溶解到甲基第三丁基醚(MTBE)中，并轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中，準(zhǔn)備進(jìn)行分析。

 

UPC²條件

 

系統(tǒng)：  配備PDA檢測器的ACQUITY UPC²

流速：  1 mL/min

流動相A：CO₂ 

流動相B：乙腈 

色譜柱： ACQUITY UPLC HSS C₁₈ 3.0 x 100 mm，1.8 µm                                              

背壓：   2500 psi 

柱度：   30 °C 

樣品稀釋劑：MTBE 

進(jìn)樣量：    1µL

樣品瓶：    沃特世玻璃瓶12 x 32 mm螺紋頸瓶，2 mL
PDA掃描范圍：210 - 600 nm 

數(shù)據(jù)管理：   Empower 3軟件 

梯度：

 

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結(jié)果與討論
已有大量文獻(xiàn)闡述了利用NPLC及RPLC分離脂溶性維生素以及類胡蘿卜素的方法。^1,3-5由于在分析脂溶性維生素時，通常需要使用低極性有機(jī)溶劑來溶解樣本，因此NPLC由于其與有機(jī)溶劑的相容性而具有一定優(yōu)勢，可允許直接進(jìn)樣脂溶性維生素或脂溶性維生素萃取物，而不需要進(jìn)行蒸發(fā)步驟。RPLC法的色譜分離效率雖然高于NPLC，⁷但由于以下幾點(diǎn)原因，阻礙了其在進(jìn)行FSV分析上的應(yīng)用：1)分析物在流動相中溶解度較低，2)對FSV的保留力強(qiáng)，導(dǎo)致運(yùn)行時間過長。最終，人們選擇使用半水性流動相(甲醇或乙腈與水的混合物)或非水性流動相；后者也稱為非水性反相(NARP) LC。^7-8 UPC²，雖然常作為正相分離技術(shù)，但也同樣適用于分離極性較低的分析物。UPC²的主流動相CO2不僅是低極性分析物的良好溶劑(與己烷的極性相近)，也可與在樣品分離過程中用于溶解這些分析物的有機(jī)溶劑(例如本研究中所使用的MTBE)相同。此外，CO₂的低極性也可促進(jìn)分析物與流動相之間的非極性相互作用，從而縮短保留時間和運(yùn)行時間。

 

在進(jìn)行方法開發(fā)時，共選用了六種色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3、ACQUITY UPLC HSS C₁₈、ACQUITY UPC² HSS SB、ACQUITY UPC² CSH氟苯基、ACQUITY UPC² 2-乙基吡啶、及ACQUITY UPC² BEH，

以及四種溶劑，包括：異丙醇(IPA)、乙腈(ACN)、乙醇、及IPA/ACN的1：1混合液。只有使用ACQUITY UPLC HSS C₁₈色譜柱以及ACN的方法才可將非常相似的維生素K1以及K2分離。采用較低的柱溫，30 °C，原因如下：首先，為了提高K1與K2的選擇性；其次，為了最大限度地減少胡蘿卜素在色譜柱上的降解，因?yàn)楹�蘿卜素非常容易氧化。

 

經(jīng)方法優(yōu)化后所得的每種成分的色譜圖以及UV譜分別如圖2及3所示。大體上，九種脂溶性維生素的洗脫順序與它們的LogP值排序相同。利用低乙腈含量(2%)的流動相就可將七種維生素全部洗脫出來，而兩種胡蘿卜素則需要使用含20%乙腈的流動相才可洗脫出來。這一現(xiàn)象，可由分析物的結(jié)構(gòu)以及它們與流動相/固定相之間的相互作用來解釋。在九種分析物中，均存在CO₂與脂溶性維生素親脂性基團(tuán)之間的非極性相互作用，而七種維生素中的氧原子(呈羰基或羧基的形式)使得分析物與流動相中的乙腈之間產(chǎn)生極性相互作用，這樣就減少了溶離時間。而兩種胡蘿卜素分子不含有雜原子，且分子中的非極性十八烷基碳鏈更容易與固定相形成較強(qiáng)的相互作用，因而其溶離時間更長。

 

 

為了測試本方法的重現(xiàn)性，將九種脂溶性維生素分別進(jìn)行六次進(jìn)樣，如圖4所示。重現(xiàn)性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)已概括在表1中。保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSDs)小于0.25%。在峰面積方面，九種脂溶性維生素中，有七種的RSDs小于1%。第一個峰(維生素A乙酸鹽)的RSD稍大，這是因?yàn)殡S著進(jìn)樣次數(shù)的增加，基線有所上升。不管怎樣，重現(xiàn)性都應(yīng)滿足質(zhì)量監(jiān)測的要求，其通常要求某一測試方法的重現(xiàn)性公差為±20%。³  

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在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們闡述了利用單次進(jìn)樣UPC²法，在四分鐘內(nèi)，將九種脂溶性維生素同時分離的方法。經(jīng)過六次重復(fù)進(jìn)樣得知，九種物質(zhì)的保留時間的RSD均小于0.25%，峰面積的RSD均小于3%(在大多數(shù)情況下<1%)。使用UPC²方法，只需進(jìn)行一次進(jìn)樣就可將混合物中的各種脂溶性維生素分析完畢，而不需要像LC法那樣進(jìn)行多次操作，從而極大地減少了實(shí)驗(yàn)室的工作量。UPC²方法所需時間是傳統(tǒng)分析方法的四分之一至十分之一。由于UPC²分析法分析速度較快，因此適于食品企業(yè)/營養(yǎng)補(bǔ)充劑企業(yè)等分析量通常較大的法規(guī)依從性監(jiān)測。

參考文獻(xiàn)

1.  Santos J, Mendiola JA, Oliveira MBPP, Ibanez E, Herrero M. Sequential determination of fat- and water-soluble vitamins in green leafy vegetables during storage. J. Chromatogr. A. 2012; 1261:179-188.

2.  http://www.prweb.com/releases/2011/10/prweb8906640.htm

3.  Blake CJ. Status of Methodology for the Determination of Fat-Soluble Vitamins 

in Foods, Dietary Supplements, and Vitamin Premixes, J. AOAC Inter. 2007; 90(4):897-910.

4.  Gomis DB, Fernandez MP, Gutierrez Alvarez MD. Simultaneous determination of fat-soluble vitamins and provitamins in milk by microcolumn liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 2000; 891:109-114.

5.  Salo-Vaananen P, Ollilainen V, Mattila P, Lehikoinen K, Salmela-Molsa E, Piironen V. Simultaneous HPLC analysis of fat-soluble vitamins in selected animal products after small-scale extraction, Food Chem. 2000;71:535-543.

6.  Aubin A. Analysis of fat-soluble vitamin capsules using UltraPerformance Convergence Chromatography. Waters Application Note 720004394en.  2012 June.

7.  Nelis HJCF, De Roose J, Vandenbaviere J, De Leenheer AP. Non-aqueous reversed-phase liquid chromatography and fluorimetry compared for determination of retinol in serum. Clin. Chem. 1983; 29(7):1431-1434.

8.  Parris NA. Non-aqueous reversed phase liquid chromatography: a neglected approach to the analysis of low-polarity samples. J Chromatogr. 1978; 157:161-170.