Xevo G2-S QTof和TransOmics:LC/MS差異組學(xué)分析系統(tǒng)

Xevo G2-S QTof和TransOmics：用于蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)的LC/MS差異組學(xué)分析系統(tǒng)
Ian Edwards、Jayne Kirk和Joanne Williams
沃特世公司(英國曼徹斯特)

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
■簡(jiǎn)化了工作流程、驗(yàn)證和數(shù)據(jù)解析
■設(shè)計(jì)用于大規(guī)模代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集
■集成式組學(xué)平臺(tái)可用于各種各樣的全面定性和定量分析

沃特世解決方案
包括TransOmics™信息學(xué)軟件的組學(xué)研究平臺(tái)解決方案
ACQUITY UPLC® I-Class 系統(tǒng)
nanoACQUITY UPLC®系統(tǒng)
Xevo® G2-S QTof
TransOmics信息學(xué)軟件
MassPREP™蛋白質(zhì)酶解標(biāo)準(zhǔn)品

關(guān)鍵詞
組學(xué)，代謝組學(xué)，脂類組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)，MS^E，主成分分析，無標(biāo)記LC/MS

簡(jiǎn)介
近年來，包括基于LC-MS的代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)儀器等組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步實(shí)現(xiàn)了以高通量的方式對(duì)多種生物分子的豐度進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)，從而測(cè)定它們?cè)诓煌�生物狀態(tài)下的變化。

我們的最終目標(biāo)是增進(jìn)對(duì)生物過程的理解，從而改善對(duì)于疾病的療效，更有效地開發(fā)藥物或維持作物生長的最佳農(nóng)業(yè)環(huán)境，同時(shí)最大程度地減少傳染和其它副作用。就此而言，不同分析學(xué)科的研究結(jié)果可提供正交的觀點(diǎn)，通�？梢曰ハ嘧鳛檠a(bǔ)充。開發(fā)和應(yīng)用能夠?qū)⒍鄠�(gè)研究領(lǐng)域的結(jié)果進(jìn)行整合的靈活信息學(xué)解決方案具有重大意義。本研究介紹了一種多組學(xué)解決方案，可用于對(duì)代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集中的MS數(shù)據(jù)進(jìn)行大規(guī)模分析。

其中采用了包括TransOmics信息學(xué)軟件的沃特世(Waters®)組學(xué)研究平臺(tái)解決方案，并結(jié)合Xevo G2-S QTof系統(tǒng)進(jìn)行技術(shù)和生物學(xué)重復(fù)分析。

結(jié)果與討論
執(zhí)行的代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)包括相對(duì)于對(duì)照/質(zhì)控樣品，鑒定低劑量和高劑量樣品。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，樣品應(yīng)當(dāng)劃分為3個(gè)不同的組，并使用標(biāo)記離子進(jìn)行不同組的識(shí)別。用于代謝組學(xué)和脂類組學(xué)的TransOmics (TOIML)流程包括以下步驟：

1. 導(dǎo)入原始的MS^E連續(xù)數(shù)據(jù)集(六個(gè)技術(shù)重復(fù)樣/組)
2. 峰對(duì)齊，糾正不同分析運(yùn)行間的保留時(shí)間偏移
3. 色譜峰歸一化，以便在不同樣品運(yùn)行間進(jìn)行比較
4. 色譜峰檢測(cè)(峰選擇)
5. 離子去卷積，按化合物將離子分組
6. 利用已有的定制數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化合物鑒定
7. 執(zhí)行數(shù)據(jù)分析，找出用以將化合物分為QC(質(zhì)控)、空白(基質(zhì))和分析物(高劑量)的離子(特征)

基質(zhì)背景包括系統(tǒng)評(píng)估基質(zhì)，其中加入了不同的鎮(zhèn)痛標(biāo)準(zhǔn)品混合物A，從而得到低劑量(QC和高劑量(空白)樣品。質(zhì)控樣品(QC)通過混合等量的低劑量和高劑量樣品而制成。

采用ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)結(jié)合Xevo G2-S QTof，在正電噴霧模式下以大于30k FWHM的質(zhì)量分辨率，分離和分析代謝物。在UPLC/MS^E模式下采集數(shù)據(jù)，該模式是一種無監(jiān)督的采集方法，其中當(dāng)進(jìn)行交替掃描時(shí)質(zhì)譜儀在低能量和高能量之間切換。使用TOIML和專業(yè)化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行處理、搜索和定量。

其中TOIML流程的步驟1，2和3在別處有詳細(xì)描述(TransOmics信息學(xué)軟件由Nonlinear Dynamics提供技術(shù)支持)。鑒定前，通過主成分分析對(duì)所檢測(cè)離子進(jìn)行分組，如圖1所示，顯示了綜合得分圖和載荷圖。從中可知，離子主要聚集在技術(shù)重復(fù)水平，并且樣品實(shí)現(xiàn)了清晰分離。

圖1. 分析物(鎮(zhèn)痛標(biāo)準(zhǔn)品混合物A高劑量；紫色)，空白(系統(tǒng)評(píng)估基質(zhì)；淺藍(lán)色)和QC(質(zhì)控樣品；深藍(lán)色)的主成分分析

接著，采用集成式搜索工具進(jìn)行化合物鑒定，以正確鑒定四種鎮(zhèn)痛標(biāo)準(zhǔn)品混合物中可在正離子電噴霧模式下檢測(cè)到的標(biāo)準(zhǔn)品。圖2展示了TOIML化合物搜索結(jié)果頁面的概覽，其中突出顯示了基于精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間(可選)和理論同位素模式分布對(duì)咖啡因的鑒定。

除了先前描述的PCA之外，TOIML中還整合了其它多變量統(tǒng)計(jì)工具，包括相關(guān)性和趨勢(shì)分析。圖3為一個(gè)示例，示出了四個(gè)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的歸一化趨勢(shì)圖，表明每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的六個(gè)技術(shù)重復(fù)樣之間有著良好的一致性，并且相對(duì)豐度與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致。

此外，TOIML還便于科學(xué)家將分析結(jié)果與其它組學(xué)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，或?yàn)橹T如EZinfo的獨(dú)立統(tǒng)計(jì)軟件包提供輸入數(shù)據(jù)。下游生物信息學(xué)(即Umetrics軟件)的結(jié)果可重新導(dǎo)入分析實(shí)驗(yàn)中，以將所有化合物數(shù)據(jù)合并為單個(gè)表格以供審查或分享。

圖2. TOIML化合物鑒定頁面。

圖3. 鎮(zhèn)痛標(biāo)準(zhǔn)品的歸一化豐度分析。

在蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，分析了兩個(gè)10 ng大腸桿菌樣品的三個(gè)重復(fù)樣，分別加入了牛血清白蛋白(BSA)、乙醇脫氫酶(ADH)，烯醇酶和糖原磷酸化酶B。第一個(gè)樣品(混合物1)中的加標(biāo)蛋白質(zhì)的柱上進(jìn)樣量均為1飛摩爾，而第二個(gè)樣品(混合物2)中的加標(biāo)蛋白質(zhì)柱上進(jìn)樣量分別為8、1、2和0.5飛摩爾。

因此，額定預(yù)期比值(混合物2:混合物1)應(yīng)為8:1、1:1、2:1和0.5:1。在本研究中，使用nanoAC-QUITY UPLC系統(tǒng)結(jié)合Xevo G2-S QTof，在LC/MS^E采集模式下對(duì)肽進(jìn)行分離和分析。采用用于蛋白組學(xué)的TransOmics (TOIP)以及含有加標(biāo)蛋白質(zhì)序列信息的種屬特異性數(shù)據(jù)庫進(jìn)行處理、搜索和定量。

TOIP流程包括以下步驟：
1. 導(dǎo)入原始的MS^E連續(xù)數(shù)據(jù)集(每個(gè)樣品有三個(gè)技術(shù)重復(fù)樣)
2. 峰對(duì)齊，糾正不同分析運(yùn)行間的保留時(shí)間偏移
3. 色譜峰歸一化，以便在不同樣品運(yùn)行間進(jìn)行比較
4. 色譜峰檢測(cè)(峰選擇)
5. 利用集成數(shù)據(jù)庫搜索算法鑒定蛋白質(zhì)和肽
6. 多變量統(tǒng)計(jì)分析
7. 絕對(duì)和相對(duì)定量

TOIP提供了與TOIML相同的多變量分析工具。圖4顯示了所檢測(cè)特征的PCA示例，即電荷態(tài)組�？擅黠@看出，特征主要聚集在技術(shù)重復(fù)水平。其中一種加標(biāo)蛋白質(zhì)消化物的肽定性鑒定結(jié)果示于圖5中，該蛋白質(zhì)中鑒定出的所有肽的歸一化表達(dá)譜如圖6所示。對(duì)后者的定量精確度類型進(jìn)行了確證，此類型可通過無標(biāo)記MS研究及基于LC/MS^E的采集策略獲得。

圖5顯示了差異加標(biāo)樣品中一個(gè)分析物的LC/MS^E采集的定性結(jié)果概覽。在本例中，BAS的柱上進(jìn)樣量為8 fmol，而大腸桿菌消化物的量為10 ng。結(jié)果如圖6所示，展示了相關(guān)的相對(duì)定量結(jié)果。

圖4. 大腸桿菌中加入的混合物1(深藍(lán)色)和混合物2(淺藍(lán)色)的特征(電荷態(tài)組)PCA圖。

圖5. 大腸桿菌中加入的不同濃度牛血清白蛋白肽的定性LC/MS^E鑒定結(jié)果。順時(shí)針顯示的依次是鑒定相關(guān)指標(biāo)(得分和誤差)、具體的輪廓線圖以及標(biāo)注的產(chǎn)物離子譜圖。

圖6. 牛血清白蛋白中鑒定出的肽的定量分析。

結(jié)論
■TransOmics信息學(xué)軟件為多組學(xué)研究提供了一個(gè)簡(jiǎn)單易用、可擴(kuò)展的系統(tǒng)
■UPLC/MS^E(LC結(jié)合數(shù)據(jù)獨(dú)立型采集MS)可在單次實(shí)驗(yàn)中提供全面的定性和定量數(shù)據(jù)集
■通過代謝物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分析可快速獲取補(bǔ)充信息并進(jìn)行關(guān)聯(lián)

下載清晰應(yīng)用紀(jì)要請(qǐng)點(diǎn)擊：