捕食應(yīng)激致大鼠的持續(xù)性情緒喚醒障礙

摘要

目的：探討嚴(yán)重心理應(yīng)激是否可引發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠較長(zhǎng)時(shí)間的情緒喚醒水平障礙，以建立較理想的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動(dòng)物模型。

 

方法：實(shí)驗(yàn)于2004- 01 /2005- 06 在解放軍成都軍區(qū)成都總醫(yī)院完成。選擇雄性Wistar 大鼠135只, 成組設(shè)計(jì)隨機(jī)分為捕食應(yīng)激組75 只和正常對(duì)照組60 只。先將大鼠放入捕食應(yīng)激實(shí)驗(yàn)箱的小籠中，再將一只饑餓的貓放入實(shí)驗(yàn)箱中，使貓與大鼠無(wú)生理傷害性接觸，致大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動(dòng)及因驚嚇?biāo)�致呼吸急促而快速鼻翼煽�?dòng)6～8 min；正常對(duì)照組大鼠除不接觸貓外，其他處理程序相同。并通過大鼠運(yùn)動(dòng)活性、探究行為、拒俘反應(yīng)性和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)觀測(cè)應(yīng)激后4個(gè)月內(nèi)實(shí)驗(yàn)大鼠情緒喚醒水平改變，同時(shí)以Morris 水迷宮法檢測(cè)其空間學(xué)習(xí)和記憶能力。采用SPSS 9.0 軟件進(jìn)行單因素或雙因素方差分析，以及各組均數(shù)的SN-K法和Tamhane’s T2 法檢驗(yàn)。

 

結(jié)果：參與實(shí)驗(yàn)大鼠135只在實(shí)驗(yàn)過程中無(wú)死亡，均進(jìn)入結(jié)果分析。①與正常對(duì)照組相比，捕食應(yīng)激后1個(gè)月內(nèi)應(yīng)激大鼠曠場(chǎng)爬越行為明顯減少[（71.5±13.5），（96.8±18.4）分，P < 0.05]；4 個(gè)月時(shí)后肢性站立仍明顯減少[（11.4±2.1），（17.9±3.3）分，P < 0.05]。②與正常對(duì)照組相比，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中應(yīng)激大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比均明顯降低[(4.8±0.9)%，(20.7±3.7)%，P < 0.01]；[(0.9±0.2)%，(6.6±1.2)%，P < 0.01]。③與正常對(duì)照組相比，拒俘反應(yīng)性則在應(yīng)激后2 個(gè)月內(nèi)明顯增加[（2.4±0.5），（1.5±0.4）分，P < 0.05]。④與正常對(duì)照組相比，捕食應(yīng)激后第1 天應(yīng)激大鼠在Morris 水迷宮空間覓向訓(xùn)練中潛伏期明顯延長(zhǎng)訓(xùn)練15 次時(shí)為(32±6)，(17±3) s，P < 0.05]，在空間定向能力測(cè)試時(shí)應(yīng)激大鼠水迷宮的4個(gè)象限中無(wú)目的漫游所花費(fèi)時(shí)間百分比差異無(wú)顯著性意義。應(yīng)激后2 周時(shí)大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力測(cè)試無(wú)明顯改變。

 

結(jié)論:單純捕食應(yīng)激成功誘發(fā)了實(shí)驗(yàn)大鼠持續(xù)性運(yùn)動(dòng)活性減少、探究行為受抑、警覺水平過高、焦慮不安狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力下降、驚恐逃避反應(yīng)等多種情緒喚醒障礙，以及短期空間學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知能力受損表現(xiàn)，具有與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙相似的致病因素與過程，可基本模擬其主要臨床表現(xiàn)。

 

主題詞：應(yīng)激障礙，創(chuàng)傷后；捕食應(yīng)激；情緒喚醒；動(dòng)物模型

 

1 材料和方法

 

設(shè)計(jì)：隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

單位：解放軍成都軍區(qū)成都總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。

材料：實(shí)驗(yàn)于2004- 01 /2005- 06 在解放軍成都軍區(qū)成都總醫(yī)院完成。選擇雄性Wistar 大鼠135 只，實(shí)驗(yàn)起始體質(zhì)量（185±9）g，由解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：scxk-（軍）2002008)。12 h 光亮/黑暗條件、22～25 ℃ 環(huán)境溫度，分隔喂養(yǎng)。成組設(shè)計(jì)隨機(jī)數(shù)字表法分為捕食應(yīng)激組75 只及正常對(duì)照組60 只。

 

儀器：按文獻(xiàn)自制捕食應(yīng)激實(shí)驗(yàn)箱（1 m×1 m×1 m 鐵絲籠，中間放置20 cm×15 cm×15 cm 小鐵絲籠，便于實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠放入其中）。按文獻(xiàn)[5, 6]自制曠場(chǎng)行為觀察箱(60 cm×60 cm×60 cm 的無(wú)頂木盒，箱底用墨線分為36 個(gè)等份小方格。用于大鼠情緒喚醒水平檢測(cè))。按文獻(xiàn)[7]制備高架十字迷宮(木質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括2 個(gè)50 cm×10 cm 的相對(duì)開臂和2 個(gè)50 cm×10 cm ×40 cm的相對(duì)閉臂，閉臂的上部是敞開的。迷宮中央有10 cm×10 cm的開闊部。迷宮離地面50 cm。用于評(píng)價(jià)大鼠焦慮樣行為改變)。按文獻(xiàn)[8]制備Morris水迷宮(直徑1.2 m、高0.5 m 的圓桶，劃為4 個(gè)象限（按順時(shí)針方向定義為A、B、C、D），盛水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，使水成為不透明的乳白色，水溫控制于22～25 ℃。將直徑11 cm平臺(tái)固定于某一象限（本實(shí)驗(yàn)中置于A 象限），平臺(tái)在水平面下1 cm。用于空間學(xué)習(xí)和記憶能力觀察)。

 

設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者：設(shè)計(jì)為第一作者，資料收集為第一、二、三作者，實(shí)施為第一、二、三、四作者，評(píng)估為第一、五作者。實(shí)驗(yàn)實(shí)施前所有參與者均經(jīng)過相關(guān)專業(yè)統(tǒng)一培訓(xùn)。

 

方法：

模型制備：先將大鼠放入捕食應(yīng)激實(shí)驗(yàn)箱的小籠中，再將1只饑餓的貓放入實(shí)驗(yàn)箱中，使貓與大鼠無(wú)生理傷害性接觸，致大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動(dòng)及因驚嚇?biāo)�致呼吸急促而快速鼻翼煽�?dòng)6～8 min，以確保實(shí)驗(yàn)大鼠相似的應(yīng)激強(qiáng)度及穩(wěn)定的應(yīng)激效應(yīng)。正常對(duì)照組大鼠除不接觸貓外，其他處理程序相同。

 

情感行為觀察：于捕食應(yīng)激后1，14 d，1，2 和4 個(gè)月時(shí)分別取正常對(duì)照組及捕食應(yīng)激組大鼠各12、15只，觀察其情感行為改變：①大鼠運(yùn)動(dòng)活性：將大鼠輕輕放入曠場(chǎng)行為觀察箱中央小方格內(nèi)，觀測(cè)5 min 內(nèi)動(dòng)物的活動(dòng)情況。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：大鼠1 /2 以上身體從所在方格進(jìn)入相鄰方格，即爬越1 次計(jì)1 分，所得總分用于評(píng)價(jià)其運(yùn)動(dòng)活性改變。②探究行為：方法同上，觀察5 min內(nèi)大鼠后肢性站立計(jì)分改變。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：后肢性站立1次計(jì)1分，總分用于評(píng)價(jià)其探究行為改變。③拒俘反應(yīng)性：以動(dòng)物從未接觸過的手套輕抓大鼠，觀察其反應(yīng)。記分標(biāo)準(zhǔn)：0 很容易抓取動(dòng)物；1 尖叫或回避；2 尖叫并回避；3 逃脫；4 逃脫并尖叫；5 咬或試圖撕咬手套；6主動(dòng)躍起攻擊；以此評(píng)價(jià)動(dòng)物恐懼與沖突素質(zhì)特征改變[6]。④高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于迷宮中央，頭朝閉臂。分別記錄5 min 內(nèi)大鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)和在兩臂滯留時(shí)間（以四肢全部入臂或出臂為準(zhǔn)），計(jì)算大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)和在開臂滯留時(shí)間分別占總次數(shù)(進(jìn)入開臂與閉臂次數(shù)之和）及總時(shí)間（在開臂與閉臂滯留時(shí)間之和）的百分比，以此為評(píng)價(jià)焦慮指標(biāo)。

 

空間學(xué)習(xí)和記憶能力觀察:采用Morris 水迷宮法[8]，觀察捕食應(yīng)激后第1 天，2 周時(shí)空間學(xué)習(xí)和記憶能力的改變。第1，2 天為空間覓向訓(xùn)練：第1 天訓(xùn)練9 次，2 min /次，記錄大鼠從不同象限入水至發(fā)現(xiàn)并爬上平臺(tái)的時(shí)間為訓(xùn)練潛伏期，每3 次的均值作為平均訓(xùn)練潛伏期；第2 天重復(fù)進(jìn)行6 次訓(xùn)練；比較所得的5 個(gè)平均訓(xùn)練潛伏期變化以分析動(dòng)物獲取空間信息的能力。第3 天進(jìn)行空間定向能力測(cè)試：先將平臺(tái)移去，再將大鼠放入水中2 min，記錄它在四個(gè)象限中停留時(shí)間的百分比，以判斷動(dòng)物記憶儲(chǔ)存及提取再現(xiàn)能力。

 

主要觀察指標(biāo)：大鼠爬越行為、后肢性站立、拒俘反應(yīng)性、高架十字迷宮開臂次數(shù)與開臂時(shí)間、Morris 水迷宮平均訓(xùn)練潛伏期及不同象限停留時(shí)間百分比。

 

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：由成都軍區(qū)成都總醫(yī)院信息科統(tǒng)計(jì)室采用SPSS 9.0 軟件進(jìn)行單因素或雙因素方差分析，以及各組均數(shù)的S- N- K法（用于方差齊性的大鼠爬越行為、拒俘反應(yīng)及開臂次數(shù)百分比的比較）和Tamhane’sT2法檢驗(yàn)（用于方差不齊性的大鼠后肢性站立、開臂時(shí)間百分比及空間學(xué)習(xí)和記憶能力改變的比較）。

 

2 結(jié)果

 

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析參與實(shí)驗(yàn)大鼠135只在實(shí)驗(yàn)過程中無(wú)死亡，均進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 大鼠捕食應(yīng)激后不同時(shí)間情感行為觀察結(jié)果

2.2.1 大鼠捕食應(yīng)激后不同時(shí)間曠場(chǎng)行為改變和高架十字迷宮行為改變結(jié)果。

表1 顯示，捕食應(yīng)激大鼠應(yīng)激后1個(gè)月內(nèi)曠場(chǎng)爬越行為明顯減少，顯示其運(yùn)動(dòng)活性降低，之后漸恢復(fù)正常；而4個(gè)月時(shí)后肢性站立仍顯著減少，表明其探究行為明顯降低。捕食應(yīng)激后4 個(gè)月內(nèi)，應(yīng)激大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比均明顯降低，并于應(yīng)激后1 個(gè)月時(shí)稍有恢復(fù)，但2個(gè)月后則進(jìn)一步降低。

2.2.2 大鼠捕食應(yīng)激后不同時(shí)間拒俘反應(yīng)性結(jié)果見表2。大鼠拒俘反應(yīng)性在應(yīng)激后2個(gè)月內(nèi)明顯增強(qiáng)。

 

3 討論

 

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙臨床表現(xiàn)多樣，包括反復(fù)重現(xiàn)創(chuàng)傷性體驗(yàn)癥狀，情感麻木與回避癥狀，警覺過強(qiáng)所致持續(xù)性焦慮、驚恐逃避反應(yīng)及易激惹癥狀等癥候群。作者的前期工作分別建立了海馬驚厥閾下電刺激和大鼠加強(qiáng)捕食應(yīng)激兩種創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動(dòng)物模型。雖然二者均可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠造型后1個(gè)月內(nèi)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙樣行為異常，但由于前者很難排除電刺激等影響因素的作用，且與創(chuàng)傷后應(yīng)急障礙的致病因素亦有較大差異；而后者采用了捕食應(yīng)激與再次環(huán)境刺激相結(jié)合的方法，很難排除2次應(yīng)激效應(yīng)的影響；同時(shí)，兩種模型觀察時(shí)間有限，且所用行為學(xué)研究方法的定量、定性分析不足，難以排除研究者主觀因素的影響；因此，有必要進(jìn)一步改進(jìn)應(yīng)激模式、控制應(yīng)激強(qiáng)度，以誘發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠更長(zhǎng)時(shí)程的應(yīng)激相關(guān)情感行為異常，并定量分析相關(guān)情緒喚醒障礙的性質(zhì)。

 

鑒于應(yīng)激因素與強(qiáng)度，以及受害者當(dāng)時(shí)的極度無(wú)助感在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)病中有重要意義，利用動(dòng)物食物鏈中特殊的捕食行為，模擬與之相似的致病因素和過程。同時(shí)，通過反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，捕食應(yīng)激4～9 min即可引發(fā)大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動(dòng)，以及因驚嚇?biāo)�致呼吸急促而快速鼻翼煽�?dòng)，而持續(xù)這種驚嚇狀態(tài)6～8 min（即總體應(yīng)激時(shí)間在11～17 min）時(shí)，可確保實(shí)驗(yàn)大鼠基本相似的應(yīng)激強(qiáng)度及穩(wěn)定的應(yīng)激效應(yīng)；更有趣的是，此時(shí)的應(yīng)激效應(yīng)亦可能最佳，并由此引發(fā)了實(shí)驗(yàn)大鼠在4 個(gè)月的觀察時(shí)間內(nèi)存在明顯的情感行為障礙；而應(yīng)激不足或過強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間過短或過長(zhǎng)，似均難以達(dá)到類似的效應(yīng)，但應(yīng)激方式和強(qiáng)度與應(yīng)激相關(guān)情感行為異常間的關(guān)系尚不能確定，有待進(jìn)一步探討。

 

曠場(chǎng)行為觀察是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情緒喚醒水平的一種重要方法。動(dòng)物初入陌生環(huán)境可出現(xiàn)明顯的防護(hù)性情感反應(yīng)，這對(duì)于量化分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的警覺水平、焦灼狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力等有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，捕食應(yīng)激大鼠應(yīng)激后1個(gè)月內(nèi)曠場(chǎng)爬越行為明顯減少，提示其新環(huán)境中運(yùn)動(dòng)活性顯著降低；拒俘反應(yīng)性則在應(yīng)激后2個(gè)月內(nèi)顯著增強(qiáng)，顯示其受驚嚇程度嚴(yán)重、沖突特性增強(qiáng)、易激惹、掙扎行為明顯；而4個(gè)月時(shí)后肢性站立仍顯著減少，表明其挫折感明顯、探究行為顯著受抑。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，捕食應(yīng)激可致實(shí)驗(yàn)大鼠在新環(huán)境中的警覺水平明顯增高、易激惹、適應(yīng)能力顯著下降，在應(yīng)激刺激后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)一直處于驚恐逃避情感反應(yīng)中。

 

高架十字迷宮試驗(yàn)則是利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性，以及對(duì)高懸敞開臂的恐懼感而形成的矛盾沖突狀態(tài)來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物焦慮素質(zhì)特征的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，捕食應(yīng)激后4個(gè)月內(nèi)，應(yīng)激大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比均明顯降低，提示捕食應(yīng)激對(duì)大鼠有明顯的長(zhǎng)時(shí)間的致焦慮效應(yīng)；有趣的是，實(shí)驗(yàn)大鼠焦慮情緒于應(yīng)激后2 周內(nèi)進(jìn)行性加重，1個(gè)月時(shí)有所緩解，但2個(gè)月后則再次進(jìn)一步加重，顯示嚴(yán)重心理應(yīng)激所致實(shí)驗(yàn)大鼠情緒喚醒障礙可能主要以焦慮相關(guān)行為為特征，與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者極為相似，具體原因尚待進(jìn)一步探討。

 

Morris 水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶模型，能較準(zhǔn)確地反映動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。在Morris 水迷宮的空間覓向訓(xùn)練期，捕食應(yīng)激后1 d 應(yīng)激大鼠較正常對(duì)照組花費(fèi)更多的時(shí)間以找尋平臺(tái)，顯示其學(xué)習(xí)和記憶的獲得與鞏固過程受到影響；而在空間定向能力測(cè)試期，應(yīng)激大鼠空間定向能力亦明顯受損，顯示捕食應(yīng)激可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶過程的不穩(wěn)定性，且對(duì)己儲(chǔ)存記憶的讀出或提取過程可能也有一定影響。而實(shí)驗(yàn)后2周時(shí)兩組動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力并無(wú)明顯差異，提示嚴(yán)重心理應(yīng)激只引發(fā)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物短期的學(xué)習(xí)和記憶能力受損，與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者存在的短暫認(rèn)知功能受損頗為相似。