使用UNIFI方案比較不同廠家雙黃連口服液成分差異

喬立瑞¹、Rob Lewis²、Alex Hooper²、James Morphet²、譚曉杰¹、Kate Yu³
1. 沃特世科技（上海）有限公司，上海，中國(guó)
2. 沃特世公司質(zhì)譜技術(shù)中心，曼徹斯特，英國(guó)
3. 沃特世公司，馬塞諸塞州米爾福德市，美國(guó)

本應(yīng)用紀(jì)要描述了如何使用沃特世（Waters®）UNIFI®天然產(chǎn)物整體解決方案中二元比較的工作流程快速準(zhǔn)確的檢定來自兩個(gè)不同廠家的雙黃連口服液化學(xué)組分的異同點(diǎn)，從而了解同一產(chǎn)品不同廠家的成分差異，也有助于同一廠家監(jiān)控不同批次間產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性。為所有類似的不同樣品二元比較的工作提出了簡(jiǎn)單、有效的解決方案。

關(guān)鍵詞:
中藥產(chǎn)品二元比較、UNIFI中藥數(shù)據(jù)庫(kù)、UPLC®/QTof MS、UNIFI 天然產(chǎn)物解決方案、UNIFI 天然產(chǎn)物工作流程、雙黃連口服液、中藥質(zhì)量監(jiān)控、產(chǎn)品批次比對(duì)

背景介紹:
中國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)藥既復(fù)雜又神奇，發(fā)展已有幾千年的歷史。但長(zhǎng)期以來，如何判斷中藥質(zhì)量的真、偽、優(yōu)、劣缺乏系統(tǒng)、科學(xué)的分析方法。比如對(duì)不同產(chǎn)地中藥材有效成份的控制，對(duì)不同栽培方式、不同采摘季節(jié)或不同加工炮制工藝后中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)等一直沒有統(tǒng)一有效的方法。近幾年來，藥學(xué)工作者在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面做了不少工作，積累了不少寶貴的經(jīng)驗(yàn)和方法。但總體來說，中藥二元比較工作耗時(shí)、成本高，甚至有的方法缺少一定的科學(xué)依據(jù)，不夠充分、客觀。本應(yīng)用紀(jì)要采用先進(jìn)的分離檢測(cè)技術(shù)結(jié)合全新的UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案對(duì)此類應(yīng)用提出了有效解決問題的思路。

不同產(chǎn)地藥材化學(xué)成分的異同、不同廠家同一產(chǎn)品的差異、同一廠家不同批次間產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性等都需要對(duì)類似樣品進(jìn)行比較，觀其成分異同，進(jìn)而找出差異，為后期的研究提供明確的指導(dǎo)方向。隨著分析儀器技術(shù)的不斷進(jìn)化，高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀器（比如UPLC/QTof MS）的使用在逐步推廣。高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀器可使樣品的分析時(shí)間縮短、分離效率提高，同時(shí)還有適應(yīng)性、專屬性高、檢測(cè)限低、進(jìn)樣量小、溶劑消耗少、自動(dòng)化程度高、定性能力高等特點(diǎn)，在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的地位也會(huì)越來越高。

本應(yīng)用紀(jì)要以兩個(gè)不同廠家的雙黃連口服液產(chǎn)品對(duì)比作為應(yīng)用實(shí)例向大家闡述最新的沃特世UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案。該解決方案以超高效液相色譜（ACQUITY UPLC® I-Class）， 四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Xevo® G2-S QTof MS）以及UNIFI中藥數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，采用UNIFI二元比較工作流程對(duì)類似的樣品進(jìn)行比較，迅速找出差異，為后期的質(zhì)量監(jiān)控和制定相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，從而大大提高了工作效率，并減少了對(duì)操作人員技術(shù)背景的要求。

雙黃連口服液的主要藥材來源為金銀花、黃芩及連翹，具有疏風(fēng)解表，清熱解毒的功效。對(duì)于上呼吸道感染、扁桃體炎、咽炎、病毒性肺炎等細(xì)菌和病毒感染性疾病有一定療效。其中黃芩苷、連翹苷、漢黃芩素是其主要活性成分。中國(guó)國(guó)內(nèi)有很多廠家都生產(chǎn)該口服液產(chǎn)品。故我們借此極有代表性的實(shí)例來闡述UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案中二元比較的工作流程（圖1）。

圖1 UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案中二元比較的工作流程

實(shí)驗(yàn)條件：

樣品處理：
取雙黃連口服液200 μl溶解于2 mL H2O中（相當(dāng)于稀釋十倍），備用。進(jìn)樣體積為1 μl。

液相色譜條件：
儀器： ACQUITY UPLC I-Class with FTN Sample Manger
色譜柱： ACQUITY UPLC HSS T3，2.1 x 100 mm 1.8 μm，40攝氏度
樣品室溫度： 15 攝氏度
流動(dòng)相A： 水 （0.1% 甲酸）
流動(dòng)相B： 乙腈

梯度:

質(zhì)譜條件：
儀器： Xevo G2-S QTof MS
采集質(zhì)量范圍： 100-1500 Da
掃描時(shí)間： 0.1 S
采集模式： ESI+和 ESI-分辨率模式，MS^E
Lock mass： 亮氨酸腦啡肽（LE） 1 ppm （0.3 S 掃描，間隔：15 S）
毛細(xì)管電壓： 3 KV （ESI+）/ 2.5 KV （ESI-）
錐孔電壓： 100V
碰撞能量（eV）： low CE： 6 /High CE： 20-45
電離源溫度： 120 攝氏度
脫溶劑溫度： 500 攝氏度
錐孔氣流速： 60 L/h
脫溶劑氣流速： 1000 L/h
數(shù)據(jù)采集時(shí)間： 15 min

結(jié)果:
采用超高效液相色譜與四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)兩個(gè)不同廠家雙黃連口服液的相關(guān)化學(xué)成分進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。采用UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案中二元比較工作流程并結(jié)合UNIFI中藥數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果明確顯示了兩個(gè)樣品中相同組分圖，差異組分圖以及每個(gè)樣品的特有組分列表。兩個(gè)廠家樣品二元比較的結(jié)果顯示廠家一的口服液中連翹酯苷A、連翹酯苷B、右旋羥基連翹酯苷A、牛蒡苷、蘆丁等的含量遠(yuǎn)高于廠家二的口服液，而廠家二口服液中黃芩苷含量則較高。

討論:
UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案包括ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜、Xevo G2-S QTof四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜以及含中藥數(shù)據(jù)庫(kù)的UNIFI軟件平臺(tái)。該解決方案中包含了五個(gè)預(yù)設(shè)的二元比較工作流程模板及一個(gè)結(jié)果報(bào)告模版，使數(shù)據(jù)的采集與處理、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、結(jié)構(gòu)確認(rèn)以及打印報(bào)告全部自動(dòng)化。

圖2是不同廠家雙黃連口服液的UPLC/QTof MS 基峰離子色譜對(duì)比圖（BPI）。此圖顯示了采用超高效液相色譜分析復(fù)雜中藥體系的優(yōu)勢(shì)，運(yùn)行時(shí)間短（有效分離時(shí)間為12 min），且分離效率與峰容量皆高。同時(shí)，四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜又提供了含精確質(zhì)量信息的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。除此之外，從圖2中可初步看出不僅這兩個(gè)生產(chǎn)廠家的化學(xué)成分復(fù)雜，而且口服液成分大多類似，如果不借助有效軟件的幫助從成分如此復(fù)雜的兩個(gè)樣品中快速準(zhǔn)確找出其共性與差異幾乎是不可能的。

圖2 雙黃連口服液的UPLC/QTof MS 基峰BPI離子色譜二元比較圖（2a：廠家一的產(chǎn)品；2b：廠家二的產(chǎn)品）。

天然產(chǎn)物研究無論是單一樣品組分定性還是不同樣品的組分比較, 明確組分的詳細(xì)信息是進(jìn)一步進(jìn)行其他研究的基礎(chǔ)。對(duì)已知藥材樣品成分分析的工作流程已在之前應(yīng)用紀(jì)要“應(yīng)用UNIFI 天然產(chǎn)物整體解決方案分析綠茶提取物中的組分”（文獻(xiàn)編號(hào)：720004837zh）有詳細(xì)闡述。我們依此工作流程，從UNIFI中藥數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入與金銀花、黃芩、連翹中藥材有關(guān)的所有化學(xué)成分，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并對(duì)樣品中的組分信息進(jìn)行鑒定。點(diǎn)擊任何一個(gè)預(yù)設(shè)的二元比較模板，便可得到與之相關(guān)的結(jié)果信息。比如，圖3便顯示了點(diǎn)擊二元比較概況總覽模板（Binary-Overview Plot）所得到的結(jié)果信息。

圖3 UNIFI軟件處理不同廠家雙黃連口服液的二元比較結(jié)果

圖3a顯示了UNIFI中預(yù)設(shè)的十四個(gè)工作流程模板。圖3b是兩個(gè)廠家樣品的UPLC/QTof組分二元比較圖。該圖中的綠色棒狀圖為與中藥數(shù)據(jù)庫(kù)所列成分所匹配且軟件自動(dòng)鑒定的成分，黑色棒狀圖為沒有找到匹配因而無法自動(dòng)鑒定的成分。圖3c是與圖3b相對(duì)應(yīng)的單一選擇離子色譜圖 （XIC）比較（該圖顯示了保留時(shí)間4.03分鐘的連翹酯苷B的XIC的比較）。圖3d則是對(duì)應(yīng)于3c所示成分的低能量通道質(zhì)譜圖比較。

若想進(jìn)一步了解兩個(gè)樣品間的異同，可分別通過點(diǎn)擊預(yù)設(shè)的Binary-Common工作模板或Binary-Difference工作模板直接看到兩個(gè)樣品間的相同成分與不同成分。比如，圖4顯示了點(diǎn)擊Binary-Common工作模板所得的結(jié)果。圖4a列出了兩個(gè)樣品中的相同組分（初步結(jié)果是1978個(gè)）。圖4b顯示了相應(yīng)于圖4a的每個(gè)組分在兩個(gè)樣品中的質(zhì)譜響應(yīng)值，反應(yīng)了該成分在每個(gè)樣品中的相對(duì)含量（該圖顯示的是漢黃芩素）。若點(diǎn)擊Binary-Difference工作模板，便可得到類似界面，結(jié)果顯示則是兩個(gè)樣品中的成分差異（初步結(jié)果是408個(gè)）。

圖4 點(diǎn)擊Binary-Common工作模板所得的結(jié)果

通過使用Binary-Common工作模板與Binary-Difference工作模板得到的兩個(gè)樣品間成分異同也可以用棒狀圖的方式更加直觀顯示。比如，在點(diǎn)擊Binary-Difference工作模板后得到兩個(gè)樣品中成分差異的結(jié)果，可通過點(diǎn)擊組分概要列表中的組分圖直接看到圖譜（圖5）。此圖使工作人員可以清晰直觀的觀察到兩個(gè)樣品間的差異。

這兩個(gè)口服液的差異結(jié)果顯示，廠家一的樣品黃芩苷含量明顯高于廠家二，而連翹中很多組分例如連翹酯苷A、連翹酯苷B、右旋羥基連翹酯苷A等成分在廠家二的含量遠(yuǎn)高于廠家一。從圖5中還直接可以看到樣品中有些組分并沒有與中藥數(shù)據(jù)庫(kù)中所列成分相匹配，因而沒有得到相關(guān)的鑒定結(jié)果。此時(shí)如有需要，可進(jìn)一步進(jìn)行手動(dòng)鑒定。

圖5 兩個(gè)口服液產(chǎn)品經(jīng)二元比較以后所得成分差異圖

兩個(gè)樣品的成分差異的詳細(xì)信息可進(jìn)一步通過應(yīng)用Binary-Reference Unique及Binary-unknown Unique這兩個(gè)工作模板了解，從而可以得到每個(gè)樣品中的特有組分列表。 UNIFI 二元比較需要將其中一個(gè)樣品列為參照樣品（色譜或質(zhì)譜峰在上），而將另一個(gè)樣品列為未知樣品（色譜或質(zhì)譜峰在下）。在我們的樣品中，我們隨意將廠家二的樣品定為參照樣品，廠家一的樣品定為未知樣品。若想進(jìn)一步觀察廠家一樣品中特有的成分直接點(diǎn)擊Binary- Unknown Unique模板即可，見圖6。結(jié)果提示廠家一特有組分193個(gè)。

圖6 點(diǎn)擊Binary- Unknown Unique模板所獲得的廠家一的樣品中特有的成分

在對(duì)結(jié)果確證滿意之后，可直接利用預(yù)設(shè)的二元比較報(bào)告模板打印報(bào)告。該報(bào)告包括了樣品的信息，樣品的采集和后處理方法，以及相同組分和不同組分信息的詳細(xì)列表。圖7為該報(bào)告中的一部分，顯示了兩個(gè)廠家的二元比較圖譜，同時(shí)色譜峰都自動(dòng)標(biāo)有化合物的名稱，結(jié)果一目了然。

圖7 通過導(dǎo)入天然產(chǎn)物組分信息總攬二元比較報(bào)告模自動(dòng)得到的報(bào)告

結(jié)論：
本應(yīng)用紀(jì)要系統(tǒng)的介紹了如何使用UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案中二元比較工作流程比較兩個(gè)不同廠家雙黃連口服液的成分異同。該工作流程以UPLC/QTof MS數(shù)據(jù)采集為基礎(chǔ)，輔以中藥數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合UNIFI中的結(jié)構(gòu)自動(dòng)鑒定功能，是嶄新的解決方案。此方案適用于解決一系列問題，比如對(duì)比不同產(chǎn)地的藥材或同一藥材的不同采摘時(shí)間及炮制過程，同一產(chǎn)品不同廠家的比較、同一廠家不同批次間產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性等等。該解決方案中含有預(yù)設(shè)的五個(gè)二元比較工作流程模板及一個(gè)與其相關(guān)的報(bào)告模板，使研究人員可以迅速的對(duì)比不同的樣品，看其成分的異同， 為后期研究提供明確的思路。最終大大提高了中藥科研與質(zhì)量監(jiān)控的有效性及工作效率。

下載清晰應(yīng)用既要請(qǐng)點(diǎn)擊：