DC-CIK細胞制備方法

 
CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的縮寫，中文全稱為“細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞”。 CIK是單個核細胞在CD3單抗和多種細胞因子(包括IFN-γ、IL-2等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應(yīng)細胞的異質(zhì)細胞群， 其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞(自然殺傷細胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。CIK細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴增等特點，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細胞。
  DC是“DendriticCells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細胞”，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC是由2011年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學(xué)家RalphM. Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells,APC)。已證實，DC是唯一能夠顯著刺激初始T細胞(Na?ve T cells)增殖的APC，而其它APC(如單核巨噬細胞、B細胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T細胞。DC是機體適應(yīng)性T細胞免疫應(yīng)答的始動者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。
  DC-CIK即DC和CIK細胞在體外共培養(yǎng)，然后回輸給患者。嚴格的說，最終的效應(yīng)細胞是經(jīng)DC體外活化的CIK細胞。多項研究表明，DC與CIK具有協(xié)同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表達及抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK的增殖能力和體內(nèi)外細胞毒活性也得以增強，因此DC-CIK較單獨的CIK治療更為有效。若將腫瘤抗原負載的DC與CIK共培養(yǎng)，可刺激產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的T細胞，這樣的DC-CIK治療則兼具特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負載腫瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更強，常被用于臨床和科研。

1．DC培養(yǎng)用細胞因子：

GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)：
  GM-CSF是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細胞和巨噬細胞的集落形成，并具有促進早期紅巨核細胞、嗜酸性祖細胞增殖和發(fā)育的?功能。GM-CSF是最早被鑒定出來對于DC有作用的細胞因子之一。
  GM-CSF在DC培養(yǎng)中的功能是促進單核細胞向大巨噬樣細胞分化，細胞表面MHC II類分子的表達得以提高，從而增強細胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF還可促進DC的存活。
IL-4(白細胞介素-4)
  IL-4在由單核細胞誘導(dǎo)成DC的過程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細胞的過度生長，從而引導(dǎo)單核細胞向DC方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4，單核細胞將分化為巨噬細胞。同時，IL-4還有降低細胞表面表達CD14分子的能力。CD14表達水平的降低是單核細胞分化為DC的重要標(biāo)志。
   GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細胞定向分化為未成熟DC(immature DC)，此時的DC具有較強的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細胞表面中度表達MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不?表達CD14。
TNF-α(腫瘤壞死因子-α)
  TNF-α可下調(diào)未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達，使細胞內(nèi)MHC II類分子區(qū)室(class IIcompartment)消失，但能夠上調(diào)細胞表面?MHCI類、II類分子和B7家族分子(CD80、CD86等)的表達，使未成熟DC分化為成熟DC(matureDC)，此時DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可極強的激活T細胞。

2．CIK培養(yǎng)用細胞因子和抗體：
CD3激發(fā)型單抗：)
  T細胞活化的第一信號來自于T細胞表面的受體，即T細胞抗原受體(T cell antigen receptor, TCR)與APC提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是T細胞對抗原的特異性識別。TCR是由2條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，在T細胞表面，其與CD3分子通過非共價鍵結(jié)合，形成TCR/CD3復(fù)合體。TCR識別特異性抗原后會引起CD3和T細胞表面的?輔助受體CD4或CD8分子的胞漿尾部聚集，進而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶(Lck、Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)進一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級聯(lián)反應(yīng)(磷脂肌醇途徑MAP激酶途徑等)，最終通過激活轉(zhuǎn)錄因子，使其進入細胞核內(nèi)，結(jié)合于調(diào)控T細胞增殖和活化的靶基因(?如IL-2和IFN-γ等)，引起基因的表達和轉(zhuǎn)錄，T細胞因而由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為增殖和活化狀態(tài)。
  由上可見，CD3分子在T細胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3激發(fā)型單抗與T細胞表面CD3分子特異性結(jié)合后，可引起CD3分子胞漿區(qū)ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進而導(dǎo)致T細胞增殖和活化的下游信號的激活，從而使T細胞增殖和活化。也就是說，CD3激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3復(fù)合物的識別和激活過程，從而引起T細胞的增殖與活化，因此是CIK細胞培養(yǎng)中不可或缺的刺激因素。
  此外，CD3激發(fā)型單抗在選用時一定要注意克隆號。研究表明，僅克隆號為OKT-3的CD3激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T細胞的增殖，而其它克隆號的CD3激發(fā)型單抗僅能刺激一部分人的T細胞。因此，在進行CIK培養(yǎng)時，最好選用OKT-3克隆，以保證每個患者的T細胞均能被激活。
IL-2(白細胞介素-2)
  IL-2最初發(fā)現(xiàn)時被稱為T細胞生長因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T細胞增殖最重要的細胞因子。IL-2既是自分泌細胞因子，也是旁分泌細胞因子，其通過與T細胞表面的IL-2受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T細胞活化，并進入細胞分裂狀態(tài)。此外，IL-2還可刺激NK細胞的生長并增強其殺傷能力。因此CIK細胞培養(yǎng)中須添加IL-2，以促進T細胞的增殖與活化。
IFN-γ(干擾素-γ)
  IFN-γ具有上調(diào)外周血淋巴細胞表面IL-2R表達的作用，因此會增強T細胞對IL-2促增殖反應(yīng)的敏感度和強度。在誘導(dǎo)CIK細胞形成的過程中加入IFN-γ，可降低IL-2的用量。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ加入的順序與CIK的細胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN-γ，培養(yǎng)24后再加入IL-2，可明顯提高CIK的細胞毒活性。
IL-1a(白細胞介素-1a)
  IL-1a也可以介導(dǎo)外周血淋巴細胞表面上調(diào)表達IL-2R。當(dāng)IL-1a與IFN-γ和激發(fā)型CD3單抗合用時，可以明顯提高CIK 的細胞毒作用。

1．外周血單個核細胞的采集
  1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞80 - 100ml；
   1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)；
   1.3 無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC，細胞數(shù)量需達到1-3 x 108。
2．(可選步驟)腫瘤抗原的制備]
   用于負載DC的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是腫瘤全細胞抗原。
  用TSA或TAA負載的DC具有很好可克服這些缺陷，因為此時無需知道那些抗原是腫瘤細胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對不同抗原決定簇的細胞毒T淋巴細胞(CTL)克隆，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的有效殺傷。
  腫瘤細胞全抗原負載DC的方法很多，包括用腫瘤細胞裂解液負載DC、用凋亡腫瘤細胞負載DC、用壞死或死亡的腫瘤細胞負載DC，用腫瘤活細胞負載DC，和將腫瘤細胞與DC融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細胞裂解液負載DC，因該方法簡單、快速、有效。
  反復(fù)凍融是獲得腫瘤細胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：
  2.1 手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；
  2.2 無菌生理鹽水洗3次；
  2.3 用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入RPMI 1640培養(yǎng)基，充分研磨；
  2.4 200目無菌網(wǎng)過濾后收集單細胞懸液；
  2.5 用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞至1-2 x 107/ml，裝入5ml無菌凍存管中；
  2.6 將凍存管浸入液氮中速凍，10 min后取出，再迅速放入37℃水浴中解凍10 min。反復(fù)3-5次；
   注：也可以-80℃/37℃反復(fù)凍融3-5次。
   2.7 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心10min；
  2.8 收取上清，0.22μm濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體；
  2.9 -80℃保存?zhèn)溆谩?BR>  3.0 CIK細胞的培養(yǎng)及鑒定
  3.1 步驟1中獲得的PBMC 用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2 x 106/ml，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)；
  3.2 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，以使單核細胞貼壁；
  3.3 收集懸浮細胞，用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1-2 x 106/ml；
  3.4 加入1,000 U/ml 的重組人IFN-γ培養(yǎng)；
  3.5 24h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細胞的生長和增殖；
   注：此時也可同時加入100U/ml的重組人IL-1a。
  3.6 每3天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2300 U/ml；
  3.7 在培養(yǎng)的第7d，收獲CIK細胞,此時數(shù)量應(yīng)達到1x109個以上；
  3.8 CIK細胞質(zhì)控：
  3.8 .1臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應(yīng)在80%以上；
  3.8 .2用流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表達，觀察CD3+CD56+細胞的比例是否明顯提高。
4.DC細胞的培養(yǎng)及鑒定

  4.1 步驟3.2中剩下的貼壁細胞(主要是CD14+的單核細胞)，加入含重組人GM-CSF 500-1,000U/ml和重組人IL-4 500U/ml的無血清培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細胞向DC細胞分化；
  4.2 每3d 半量換液一次，并補足細胞因子；
  4.3 (可選步驟)?在培養(yǎng)的第5d, 加入步驟2中獲得的腫瘤抗原50 mg/ml，對DC進行抗原負載；
  注：若不對?DC?進行抗原負載，該步省略。
  4.4 在培養(yǎng)的第6d，加入重組人TNF-α(500U/ml)，誘導(dǎo)DC細胞成熟；
  4.5 在培養(yǎng)的第7d或第8d，收獲DC 細胞，其數(shù)量應(yīng)達到1×106個以上；
  4.6 DC的質(zhì)檢：
  4.6 .1臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應(yīng)在80%以上；
  4.6 .2流式細胞儀檢測DC 細胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表達以確定DC是否成熟。
  5.0 DC-CIK細胞的制備和質(zhì)檢
  5.1 收集步驟4和步驟3中所獲得的DC 細胞和CIK 細胞，按1:10(數(shù)目比)的比例共培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)液中添加重組人IL-2 (300 U/ml)；
  5.2 每3天半量換液一次，并補加重組人IL-2 (300U/ml)。
  5.3  在第7d 收集細胞，細胞數(shù)量應(yīng)達到1×1010個以上；
  5.4  DC-CIK細胞的質(zhì)檢：
  5.4 .1臺盼藍染色檢測：活細胞應(yīng)在80%以上；
  5.4 .2流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達：CD3+CD56+細胞的比例應(yīng)在20%以上。
  5.4 .3細胞殺傷實驗：以DC-CIK細胞為效應(yīng)細胞，以腫瘤細胞(可為原代腫瘤細胞或腫瘤細胞株)為靶細胞，將效應(yīng)細胞與靶細胞按10:1(數(shù)目比)的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶細胞1 x 104個，終體積為200ml，設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷率。
   5.4 .4收獲細胞前，取少量培養(yǎng)物進行細菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標(biāo)準(zhǔn)：病原學(xué)檢測陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。

注：AF即Animal Free意為無動物成分。無動物成分的重組細胞因子在生產(chǎn)過程中不會有任何動物源性物質(zhì)，尤其是牛蛋白的混入，使得最終獲得的重組人蛋白中不含任何動物成分。這樣可避免動物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的機體異種排斥和過敏反應(yīng)，因此細胞治療的體外細胞培養(yǎng)過程中最好使用無動物成分的重組細胞因子。

[1] Steinman RM, Cohn ZA. "Identification of a novelcell type in peripheral lymphoid organs of mice.I. Morphology, quantitation,tissue distribution".J. Exp. Med.?1973; 137 (5): 1142–62.
[2] 張志偉，宋鑫。DC-CIK 細胞臨床制備規(guī)范化研究。中國腫瘤，2011；20(2)：85-88.
[3] Li R,Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killercell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother.2012; 61:2125–2133.

(轉(zhuǎn)載自)

 閱讀原文：