使用UPC2/MS/MS對(duì)蛋白沉淀血漿中的極性化合物直接進(jìn)樣

Jennifer L. Simeone and Paul D. Rainville

目的
對(duì)蛋白沉淀血漿中的強(qiáng)極性化合物直接進(jìn)樣分離，以進(jìn)行生物分析。

背景
大多數(shù)生物分析方法都采用蛋白質(zhì)沉淀(PPT)提取法，這是因?yàn)樵摷夹g(shù)簡(jiǎn)單、快速且成本較低。典型的PPT使用3:1的有機(jī)溶劑與生物樣品，可得到大約75%的有機(jī)提取物。傳統(tǒng)上，通常會(huì)采用反相液相色譜(RPLC)分析樣品。對(duì)于強(qiáng)極性化合物而言，由于強(qiáng)溶劑作用產(chǎn)生的色譜峰形較差，最為明顯的是出現(xiàn)峰前伸和/或譜峰分叉，因此不能直接將高濃度有機(jī)提取物注入RPLC系統(tǒng)。因此，在向色譜系統(tǒng)進(jìn)樣之前需要進(jìn)行額外的樣品處理，包括蒸發(fā)和復(fù)溶或用水稀釋。

通過從RPLC到UPC²改變MS入口技術(shù)，無(wú)需蒸發(fā)和復(fù)溶等額外樣品制備步驟，便可以直接進(jìn)樣分離高度有機(jī)樣品中的極性化合物。

圖1. 在反相模式下運(yùn)行的UPLC®中，咖啡因PPT提取物通過(a)1 µL進(jìn)樣、(b)3µL進(jìn)樣獲得的示例色譜圖，以及在ACQUITY UPC²系統(tǒng)中，相同咖啡因PPT提取物的(c)7µL進(jìn)樣示例色譜圖。

解決方案
UltraPerformance Convergence Chromatography™(UPC²®)使用超臨界二氧化碳作為主要流動(dòng)相，其保留機(jī)制與RPLC不同，可直接進(jìn)樣高度有機(jī)提取物。在本示例中，通過PPT提取法使用乙腈以3:1的比率從大鼠血漿中提取了四種極性較強(qiáng)的化合物，直接進(jìn)樣至ACQUITY UPC²™系統(tǒng)中，并使用傳統(tǒng)RPLC系統(tǒng)作為對(duì)比。UPC²分析在ACQUITY UPC² BEH色譜柱上進(jìn)行，采用經(jīng)氫氧化銨改性的甲醇作為共溶劑(流動(dòng)相B)。RPLC分析在配備ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱的ACQUITY UPLC®系統(tǒng)上進(jìn)行，采用水和經(jīng)氫氧化銨改性的乙腈作為流動(dòng)相。

圖1將含咖啡因的PPT提取物在ACQUITY UPLC系統(tǒng)中的1µL直接進(jìn)樣和3 µL直接進(jìn)樣與在ACQUITYUPC²系統(tǒng)中的7µL進(jìn)樣進(jìn)行了對(duì)比。RPLC中的1µL進(jìn)樣顯示出良好的峰形，但在3µL進(jìn)樣體積下峰形發(fā)生變形，可以觀察到前伸峰和譜峰分叉。而采用UPC²進(jìn)行的7µL進(jìn)樣依然表現(xiàn)出良好的峰形。以相同方式測(cè)試的其它極性分子也觀察到類似的結(jié)果(表1)。表1還顯示了使用RPLC和UPC²時(shí)，在PPT提取物中測(cè)試的所有分析物的最大進(jìn)樣體積。

這些數(shù)據(jù)明確證實(shí)了使用ACQUITY UPC²系統(tǒng)分析高度有機(jī)提取物中極性化合物的優(yōu)勢(shì)，并且不必像RPLC系統(tǒng)那樣在進(jìn)樣前需要進(jìn)行額外的樣品制備，從而簡(jiǎn)化了工作流程。

總結(jié)
通過從標(biāo)準(zhǔn)RPLC到UPC²改變MS入口技術(shù)，無(wú)需蒸發(fā)和復(fù)溶等額外樣品制備步驟，便可以直接在ACQUITY UPC²系統(tǒng)中注入溶于高度有機(jī)樣品中的極性化合物。為生物分析實(shí)驗(yàn)室增添UPC²可以簡(jiǎn)化高度有機(jī)樣品制劑中極性化合物的分析。