ClonePix結(jié)合CloneSelect Imager技術(shù)加強開發(fā)病毒特異性的雜交瘤細胞
材料
1.ClonePix System (Molecular Devices, LLC)
2.CloneSelect Imager (Molecular Devices, LLC)
3.CloneMedia Semi-Solid Media for hybridomas/myelomas (Molecular Devices, LLC Cat #K8600/K8610)
4.CloneDetect Reagent, Mouse IgG (H+L) Specific,Fluorescein (Molecular Devices, LLC Cat #K8220)
挽救低產(chǎn)量的雜交瘤細胞
傳統(tǒng)雜交瘤開發(fā)的方法涉及骨髓瘤細胞和抗原免疫過的宿主脾細胞的化學(xué)介導(dǎo)融合過程。融合的雜交瘤細胞經(jīng)歷了眾所周知漫長和低效率的有限稀釋法的選擇過程，接著用ELISA方法篩選分離出有限數(shù)目的抗原特異性單克隆雜交瘤細胞。太長的時間戰(zhàn)線（超過30周）和大量的處理過程，使有限稀釋法產(chǎn)生不能準確量化活性和生產(chǎn)力的低滴度細胞系。
最早的雙鏈DNA 病毒特異性雜交瘤細胞系是1990s用有限稀釋方法開發(fā)的，但是篩選的雜交瘤細胞單克隆性和穩(wěn)定性都不是很好。用不同的血清和培養(yǎng)基組分進行多年的重復(fù)培養(yǎng)（靜態(tài)的和旋轉(zhuǎn)的），這些克隆表現(xiàn)出不穩(wěn)定（圖1）。而且，抗體的產(chǎn)率從來沒有超過3mg/L。由于在preps中能觀察的差別巨大的聚集物，使得純化的IgG的質(zhì)量很難保持一致性。
通過亞克隆高滴度抗體的親本細胞系，挽回和穩(wěn)定特異性的雜交瘤細胞系。ClonePix技術(shù)平臺利用半固體培養(yǎng)基和CloneDetect無標記檢測技術(shù)重篩了大量以前融合的雜交瘤細胞（圖2），顯示了明顯的技術(shù)優(yōu)勢。
快速分離分泌抗體的高產(chǎn)克隆
ClonePix系統(tǒng)在流程效率和成本節(jié)約方面顯示了顯著改善，增加了發(fā)現(xiàn)稀有分泌子的概率。因此，ClonePix2技術(shù)單克隆抗體產(chǎn)生的時間減少到有限稀釋法的一半。
在這個過程中，首先擴增親本雜交瘤克隆的數(shù)量，然后ClonePix分析和挑選想要的克隆。配合使用FITC標記的CloneDetect 試劑，ClonePix系統(tǒng)成像和分析熒光強度。FITC陽性克隆根據(jù)克隆外部平均熒光強度由高到低進行排序�？傊瑑H僅5-6%的480-FITC的陽性克隆被挑取。相比大的、快速生長的陰性克�。�70-150個細胞）（圖3），大多數(shù)高分泌的克隆更�。�40-60個細胞）。
480個高產(chǎn)克隆從半固體培養(yǎng)基挑取到5塊96孔含200‑μL 液體培養(yǎng)基的微孔板中，培養(yǎng)3天。為了客觀和定量評估細胞數(shù)，使用CloneSelect Imager系統(tǒng)成像96孔板中的克隆。超快的成像速度（96孔板小于90sec）能夠快速監(jiān)控和評估5天克隆的生長。通過有效的利用CloneSelect Imager的成像，分離到前146個生長速度快的克�。▓D4）。
篩選和識別中試規(guī)模分析的亞克隆
用合成的具有抗體表位的多肽，對篩選到的前146生長速率的克隆進行抗原特異性分析。多肽和抗體顯示了很強的的親和性，完全符合前期研究的闡釋，因此，合成的多肽用來篩選新的，具有高抗體親和性的亞克隆。
生物素標記的多肽加載在含鏈霉素的微孔板表面，再加146個沒有稀釋的雜交瘤細胞上清液，測定IgG的結(jié)合能力。從中選取了前7個顯示了最優(yōu)結(jié)合力的特殊亞克隆。
高IgG分泌亞克隆的中試規(guī)模生產(chǎn)
7個高價值特異的亞克隆在液體培養(yǎng)基規(guī)模化生產(chǎn)。這些克隆被擴增，一旦獲得足夠的培養(yǎng)基體積，5個亞克隆被冷凍用于將來的研究參考。而剩下的2個高親和/高IgG分泌克隆繼續(xù)擴增2-3周，直到完成中試生產(chǎn)（1升）。
挽救低產(chǎn)量雜交瘤細胞的工作流程
為了識別用于發(fā)展高級診斷的雙鏈DNA病毒特異抗體的亞克隆，ClonePix技術(shù)篩選480FITC陽性的雜交瘤克隆，基于半固體培養(yǎng)基技術(shù)和FITC標記的CloneDetect試劑。CloneSelect Imager 識別了其中146個快速生產(chǎn)的克隆，7個高產(chǎn)量的克隆被確認和目標多肽具有高度的特異性。選擇其中的2個亞克隆進行中試生產(chǎn)和剩余的5個作為細胞銀行。這個流程降低了雜交瘤細胞的篩選時間，最多為常規(guī)有限稀釋法篩選時間的50%，而且篩選了強健的目標克隆細胞作為其他附加的研究和生產(chǎn)。
單克隆的驗證和IgG分泌子的均一化
ClonePix系統(tǒng)再克隆和特異性確認之后，2個亞克隆擴增，重新種到具有CloneDetect試劑的半固體培養(yǎng)基的6孔板中。ClonePix系統(tǒng)成像和分析表明克隆正常的分泌了IgG，同時，通過均相均一化過程，能觀察到高產(chǎn)IgG的克�。▓D5）。
新雙鏈DNA病毒雜交瘤細胞亞克隆的生產(chǎn)能力
利用ClonePix技術(shù)重新篩選低產(chǎn)量的親本克隆。高產(chǎn)、穩(wěn)定的亞克隆被挽回。Protein G純化單克隆抗體，定量總產(chǎn)量。相比親本克隆的歷史產(chǎn)量（~1mg/L），新的亞克隆細胞IgG的產(chǎn)量明顯地增加（17-25mg/L），圖6顯示。
結(jié)論
ClonePix技術(shù)改善了篩選時間周期和亞克隆雜交瘤細胞的質(zhì)量，降低手動操作。而且，CloneMatrix Media和CloneDetect 試劑提高了分泌克隆的生長和檢測靈敏度。ClonePix的數(shù)據(jù)表明親本的低生產(chǎn)力源于小數(shù)目生產(chǎn)抗體的細胞被快速、無生產(chǎn)抗體能力的細胞壓制。
相比親本雜交瘤細胞的產(chǎn)量（05-1mg/L）， 結(jié)合CloneSelect Imager的使用，ClonePix 系統(tǒng)被證明是能識別高產(chǎn)（17-25mg/L）、高親和力雜交瘤細胞亞克隆的強有力工具。因此，該技術(shù)有助于推進雙鏈DNA病毒特異性的新治療性抗體的發(fā)展。
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