Caspase活化、核染色質(zhì)固縮及DNA片段化
瀏覽次數(shù)：8243 發(fā)布日期：2014-4-4
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Life Technologies提供了用于細(xì)胞功能和健康檢測(cè)的各種試劑。其中許多分析以熒光或比色法為基礎(chǔ)，具有靈敏性、便利性和安全性。這些產(chǎn)品已經(jīng)過(guò)多種儀器平臺(tái)驗(yàn)證，包括顯微鏡、流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀和高內(nèi)涵篩選，能夠?qū)崿F(xiàn)各種細(xì)胞功能的分析：
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細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性
細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期
細(xì)胞凋亡
自噬
氧化應(yīng)激
內(nèi)吞作用和吞噬作用
細(xì)胞內(nèi)離子 |
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細(xì)胞凋亡(細(xì)胞程序性死亡)是細(xì)胞正常發(fā)育過(guò)程中，由遺傳控制的細(xì)胞消亡現(xiàn)象。凋亡調(diào)控異常與許多疾病狀態(tài)有關(guān)，例如阿爾茨海默病、中風(fēng)以及癌癥。區(qū)別于壞死細(xì)胞的是，凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征為核染色質(zhì)固縮、細(xì)胞皺縮以及產(chǎn)生膜包裹凋亡小體。細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)特征在于基因組的片段化及幾種細(xì)胞蛋白的解離或降解。
與細(xì)胞活性一樣，無(wú)法通過(guò)任何單一參數(shù)來(lái)準(zhǔn)確界定細(xì)胞徹底死亡；因而采用幾種不同的方法研究細(xì)胞凋亡通常十分有利。候選抗腫瘤藥物若無(wú)法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其臨床功效通常較差，因此凋亡分析成為重要的高通量藥物篩選工具。
Vybrant® FAM Caspase Assay Kit和Image-iT® LIVE Caspase Detection Kit以新穎技術(shù)檢測(cè)活細(xì)胞中活化的caspase，利用的是caspase的熒光抑制劑(FLICA™)。此試劑中的FMK可通過(guò)caspase特異性氨基酸序列與cysteine進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)，并接上carboxyfluorescein基團(tuán)(FAM)作為信號(hào)報(bào)告分子。FLICA™可通過(guò)識(shí)別序列與活化的caspase的酶反應(yīng)中心相互作用，接著通過(guò)FMK共價(jià)結(jié)合。FLICA™抑制劑可穿透細(xì)胞，且不具細(xì)胞毒性。未結(jié)合的FLICA™分子會(huì)擴(kuò)散至細(xì)胞外，經(jīng)沖洗即可去除；剩余的綠色熒光信號(hào)則可直接反映出加入抑制劑時(shí)處于活化狀態(tài)的capase量。Vybrant® FAM Caspase Assay Kit可用于流式檢測(cè)，Image-iT® LIVE Caspase Detection Kit則可用于成像。
圖7. 使用Vybrant® FAM Caspase Assay Kit的原理及檢測(cè)結(jié)果示例。
CellEvent® Caspase-3/7 Green檢測(cè)試劑是一種適用于活化的 caspase-3/7的新型熒光底物，可用于活細(xì)胞及固定細(xì)胞成像，最大吸收/發(fā)射波長(zhǎng)約為 502/530 nm。該產(chǎn)品是一個(gè)與核酸結(jié)合染料相連的四個(gè)氨基酸多肽(DEVD)，在凋亡細(xì)胞中，caspase-3/7 活化后，DEVD 肽被切斷，使染料能夠與DNA 結(jié)合，并產(chǎn)生明亮的熒光。CellEvent® 試劑適用于成像(圖8)、高內(nèi)涵篩選和流式細(xì)胞術(shù)。
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圖8. 細(xì)胞凋亡的多色成像。 使用 30 μM 依托泊苷處理U2OS細(xì)胞18小時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。首先采用7.5 μM CellEvent® Caspase-3/7 Green 檢測(cè)試劑(C10423，綠色熒光)對(duì)處理細(xì)胞進(jìn)行染色，檢測(cè)細(xì)胞凋亡，用Hoechst 33342核酸染料(H3570，藍(lán)色熒光)標(biāo)記細(xì)胞核，然后用 150 nM MitoTracker® Deep Red FM (M22426，粉色熒光) 標(biāo)記線粒體。經(jīng)固定和透化處理后，采用Alexa Fluor® 546鬼筆環(huán)肽(A22283，橙色熒光)標(biāo)記肌動(dòng)蛋白。 |
在凋亡過(guò)程中，ICE家族成員如caspase-3及caspase-7會(huì)將PARP裂解而產(chǎn)生85 kDa和25 kDa的片段。RARP裂解是細(xì)胞凋亡中最典型的特征之一。Anti-PARP FITC Apoptosis Kit包含了具FITC結(jié)合物的anti-PARP抗體，能專(zhuān)一性辨識(shí)裂解后的PARP所產(chǎn)生的85 kDa (p85)片段，而排除完整全長(zhǎng)的PARP蛋白。細(xì)胞可利用流式細(xì)胞儀加以分析，并以陽(yáng)性FITC染色檢測(cè)正處于細(xì)胞凋亡過(guò)程的細(xì)胞百分比。
在凋亡細(xì)胞中，核染色質(zhì)固縮的情形會(huì)增加，這些壓縮的細(xì)胞核經(jīng)部分核染料標(biāo)記后，會(huì)呈現(xiàn)高度熒光狀態(tài)。Hoechst33342為可經(jīng)UV激發(fā)的核酸染料，能輕易地被所有細(xì)胞吸收。此染料的藍(lán)色熒光在凋亡細(xì)胞的的濃縮細(xì)胞核中格外明亮。相比之下，PI僅能進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)胞。同時(shí)使用這兩種染料，便能以流式細(xì)胞儀或熒光顯微技術(shù)獲得的染色結(jié)果區(qū)別健康細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。
圖9. Jukat細(xì)胞經(jīng)10 μM 喜樹(shù)堿處理4小時(shí)(右圖)或未處理(左圖)后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。經(jīng)喜樹(shù)堿處理后的細(xì)胞具有更高比例的凋亡細(xì)胞。L=活細(xì)胞, D=死細(xì)胞, A=凋亡細(xì)胞。 |
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細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)生的DNA片段化會(huì)導(dǎo)致DNA鏈斷裂。TUNEL檢測(cè)(terminal deoxynucleotidyl transferase dUPT nick end labeling)則廣泛應(yīng)用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞中的DNA缺口。DNA片段化是檢測(cè)細(xì)胞凋亡末期階段最可靠的方法之一，DNA片段經(jīng)核酸酶裂解或造成切口后，會(huì)暴露出大量的3’-羥基端。這些末端接著通過(guò)TUNEL技術(shù)以BrdUTP及terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)加以標(biāo)記。一旦嵌入DNA后，BrdU便能利用標(biāo)有Alexa Fluor® 488或FITC的anti-BrdU抗體進(jìn)行檢測(cè)。
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圖10. 人淋巴瘤細(xì)胞經(jīng)喜樹(shù)堿處理4h后，使用APO-BrdU™ TUNEL Assay Kit (A23210)檢測(cè)。具有DNA鏈缺口的凋亡細(xì)胞可通過(guò)TUNEL和綠色熒光檢測(cè)到，而壞死細(xì)胞則被紅色熒光的PI染色。 | | |
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