傳統(tǒng)方法的全新應(yīng)用——壓力衰減法在一次性生物工藝袋中的泄漏測試

一次性使用技術(shù)如今已被廣泛接受和使用，特別是一次性使用袋子已被廣泛的應(yīng)用于生物工藝上下游的各個工藝環(huán)節(jié)。盡管制造供應(yīng)商的質(zhì)量保證體系確保了一次性使用袋子出廠時的零泄露，但是如何解決因運(yùn)輸、安裝或其它錯誤操作所造成的風(fēng)險呢？當(dāng)然，操作員培訓(xùn)與執(zhí)行合適的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOPs）是一種可行的必須的方式，但是它們是降低風(fēng)險的唯一方法嗎？此外，更多公司都在倡導(dǎo)將“舞廳概念”應(yīng)用于生物制藥藥物原材料與終產(chǎn)品的生產(chǎn)制造上。然而，你該如何證明所使用的單元操作是密閉的，而且中間工藝環(huán)節(jié)不會遭受交叉污染的風(fēng)險呢？

細(xì)胞生長所需的昂貴培養(yǎng)基與典型細(xì)胞培養(yǎng)工藝的長持續(xù)時間都促使著我們不得不在建立批次時詳細(xì)嚴(yán)密的審查一次性生物反應(yīng)袋的密閉性。一個泄露的生物反應(yīng)器將會導(dǎo)致重大的經(jīng)濟(jì)損失，并且會破壞遵循良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)的工廠內(nèi)對時間有著周密安排的生產(chǎn)計(jì)劃。在疫苗生產(chǎn)工藝中，這樣的泄露還可能直接威脅到操作員以及周圍環(huán)境的安全性，因此無論如何都必須要尋找一種實(shí)際可行的方法來規(guī)避這種情況的發(fā)生。

安裝后使用前的測試有助于降低風(fēng)險

根據(jù)法規(guī)指南及可行性指導(dǎo)方針，除菌級過濾器和一次性使用袋子的完整性測試有著明顯的區(qū)別。根據(jù)現(xiàn)行歐盟GMP法規(guī)（國際指南中最嚴(yán)格的法規(guī)），除菌級過濾器應(yīng)在滅菌后使用前進(jìn)行完整性測試，同時還應(yīng)在使用后立即進(jìn)行測試。一次性使用袋子沒有相關(guān)的法規(guī)要求，盡管如此，整個一次性使用生物反應(yīng)器系統(tǒng)（包括管道）仍然有必要在安裝后使用前進(jìn)行袋子的泄漏測試，這樣能夠檢測出典型的可能由操作人員手動失誤造成的泄露，極大改善一次性使用生產(chǎn)設(shè)備的風(fēng)險轉(zhuǎn)移能力，同時也能增強(qiáng)操作人員的安全性，提升產(chǎn)品性能的穩(wěn)定與生物藥品交付上市的及時性，從而保障經(jīng)濟(jì)和投資的安全性。以一個典型的潛在風(fēng)險的實(shí)際情況為例：在生物反應(yīng)器的組裝過程中和培養(yǎng)基配制時，還有接種液的轉(zhuǎn)移過程中將不同的管道元件進(jìn)行了錯誤的連接。這些關(guān)鍵操作中操作員的一個錯誤就可能導(dǎo)致泄漏，隨之可能潛在地發(fā)生污染，從而導(dǎo)致一個批次的報廢。

不同測試方法之比較

曾有40 多種不同的基于大量技術(shù)的測試方法被嘗試用于泄漏檢測（如，根據(jù)EN1779 條“泄漏測試：方法和技術(shù)選擇的標(biāo)準(zhǔn)”），比如氣體泄漏檢測（完整檢測或探測）、熱成像、流量測定、壓力衰減以及壓力增加等。每項(xiàng)技術(shù)在如下方面都擁有自己的優(yōu)勢和弱勢：
•精確度和可重復(fù)性
•停留時間
•操作方面因素
•測試后袋子情況
•與袋子連在一起進(jìn)行測試的可能性
•設(shè)備的投資成本
•每次測試的費(fèi)用
•測試設(shè)備的占地空間
•與測試本身相關(guān)的污染風(fēng)險
•防塵防濺級別
•原位測試（使用位置）的可行性

在為一次性使用生物反應(yīng)器開發(fā)一個合適的袋子測試設(shè)備時，上述因素必須要進(jìn)行仔細(xì)考慮與平衡，使之能很好地應(yīng)用于疫苗、單抗和重組蛋白的GMP生產(chǎn)。

具備用于安裝后使用前測試資質(zhì)的方法極少

當(dāng)一次性使用生物反應(yīng)器安裝于夾持器時，存在一個潛在的操作失誤風(fēng)險。因此若想可靠地為這些袋子完成泄露測試，必須要在所使用的位置進(jìn)行（使用前安裝后）。如果在一個單獨(dú)的設(shè)備里測試一次性使用生物反應(yīng)器袋子（正如進(jìn)行氣體泄露檢測時所常用的方法），然后再將其安裝至袋子夾持器，這樣依然無法檢測出操作員手動錯誤所導(dǎo)致的泄露，而只能是對于潛在的運(yùn)輸破壞進(jìn)行彌補(bǔ)性檢測。另外，氣體泄露檢測技術(shù)不僅復(fù)雜，而且具有一定的成本，因此將之作為一個例行的測試方法顯得不夠現(xiàn)實(shí)。實(shí)際上，合適的完整包裝（制造商負(fù)責(zé)）和紙板箱的檢查（客戶負(fù)責(zé)）即可發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸造成的破壞。

質(zhì)量或體積流量測量是一項(xiàng)普及的技術(shù)，但它需要在整個測試過程中都具備一個非常精確的壓力控制。初始測試壓力只要發(fā)生輕微的上升或下降，便會直接影響所測量的流量，并導(dǎo)致測試值的錯誤估算。體積越大，精確調(diào)節(jié)壓力的難度也越大。因此該項(xiàng)技術(shù)不適用于大體積測試。

從另一角度來看，壓力衰減技術(shù)是一項(xiàng)穩(wěn)固、易于實(shí)施、經(jīng)濟(jì)并且獲驗(yàn)證的技術(shù)，可用于測試直接安裝于固定夾持器的一次性使用生物反應(yīng)器袋子。因此我們使用這種方法開發(fā)出了一個既可靠又可預(yù)測泄漏從而降低風(fēng)險的工具。

開發(fā)一個可靠并可重復(fù)的方法

任何測試方法的目標(biāo)都必須是能夠可靠地證明所安裝的生物反應(yīng)器袋子的罩袋密封圈、端口焊接、連接以及所有袋子表面的潛在泄漏風(fēng)險。任何泄漏風(fēng)險都可能導(dǎo)致生物反應(yīng)器內(nèi)部物質(zhì)的損失，或引發(fā)生物安全威脅。在早期基于壓力衰減的一個方法的開發(fā)過程中，我們證明了當(dāng)擠壓光滑、堅(jiān)硬的塑料袋表面時，其泄露情況能夠完全被掩蓋。極少的測試氣體可從泄露處跑出，導(dǎo)致壓力衰減檢測的可靠性為零。因此，對安裝于夾持器上的袋子，或者甚至在沒有任何多孔墊片將袋子與平板表面隔離開的情況下，對兩塊支撐板之間隨意放置的袋子進(jìn)行壓力衰減或流量測定，都將無法代表一個可靠的測試安裝方式，就是由于存在著掩蓋效應(yīng)。

采用一種特殊設(shè)計(jì)并且具有專利保護(hù)的聚乙烯絨布作為生物反應(yīng)器塑料薄膜和夾持器之間的多孔隔離層可防止掩蓋效應(yīng)的產(chǎn)生（圖1）。與用相同的測試方法在非硬表面袋子區(qū)域所獲得的結(jié)果相比，采用多孔隔離層提供了可靠、可重復(fù)的測試數(shù)據(jù)。

壓力衰減測試方法

完善的壓力衰減測試方法所依據(jù)的是來自于美國材料試驗(yàn)協(xié)會ASTMF2095-01(3)的方案。來自賽多利斯斯泰迪生物技術(shù)有限公司的Sartocheck4 plus 袋子測試儀，與上述可防止因
安裝而潛在引入的泄露掩蓋的袋子測試儀絨布聯(lián)合使用，可以確保一次性使用生物反應(yīng)器袋子在其最終的袋子夾持器內(nèi)，于安裝后使用前的使用點(diǎn)所完成的泄露測試，該方法的測試結(jié)
果安全可靠。

壓力衰減測量值對溫度的變化非常敏感。因此，Sartocheck4 plus 袋子測試儀還提供一支環(huán)境溫度測量計(jì)，如果在測試階段溫度變化過大，則會產(chǎn)生一個警告信號。目前為止，這個壓力衰減方法用于泄露測試的應(yīng)用技術(shù)已被拓展為可靠地檢測50L 至1000L 全線的BIOSTATSTR 一次性使用生物反應(yīng)器袋子的泄漏風(fēng)險。此方法針對2000L 規(guī)模袋子的資質(zhì)證明仍在進(jìn)行之中。未來還將可以測試一次性使用的2D/3D 儲液袋。

由于袋子是在安裝之后進(jìn)行測試，因此潛在的泄露可在袋子膜壁、密封圈、整個靈活袋子系統(tǒng)的連接點(diǎn)、以及管道處進(jìn)行檢測。測試方法是非破壞性的，在生物制品生產(chǎn)設(shè)備使用中完全可以實(shí)現(xiàn)可靠并且可重復(fù)的使用點(diǎn)泄漏測試（圖2）。實(shí)際測試時壓力衰減測得值需要與方法確認(rèn)和驗(yàn)證時相關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較后，才能得出最終是否通過泄漏測試的結(jié)果

初始研究建立已確認(rèn)和驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)限值

驗(yàn)證方法由兩部分組成：
 1、工程研究，以確定不同袋子體積的檢測限
 2、正式的資質(zhì)確認(rèn)，以證明最小的可檢測裂縫尺寸，并為測試確定驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)

為確定最小的可檢測裂縫尺寸，采用一個簡化配置的袋子，該袋子只有一個底部端口連接用于測試氣體進(jìn)出，同時具有多處“缺陷補(bǔ)丁”代表不同的明確的裂縫尺寸。一個缺陷補(bǔ)丁就是一塊帶有激光鉆孔并且經(jīng)過流量校準(zhǔn)的裂縫的圓形膜片，焊接于袋子表面。為了對已知的裂縫尺寸進(jìn)行可靠檢測，在已知裂縫尺寸的袋子與無缺陷袋子之間必須有顯著的壓力衰減差。通過大量重復(fù)測試，計(jì)算出用于不同裂縫尺寸和無缺陷袋子的測試值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。最小可檢測的裂縫尺寸定義為：裂縫尺寸的最低的壓力衰減值至少有六次高于無裂縫袋子的最高壓力衰減值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖3 顯示了一個200L 袋子體積的不同檢測補(bǔ)丁尺寸的測試結(jié)果。為一個50μm缺陷補(bǔ)丁所測量的壓力衰減值與一個無泄漏袋子所測結(jié)果一致。因此，一個50μm的裂縫無法可靠地與無泄漏袋子區(qū)分開來。相反，100μm的裂縫尺寸則顯示出與無泄漏袋子明顯的區(qū)別。

第二步中，一個標(biāo)準(zhǔn)的無缺陷補(bǔ)丁的袋子和一個標(biāo)準(zhǔn)的帶有一個預(yù)先確定最小可檢測裂縫尺寸的缺陷補(bǔ)丁的袋子被共同用于建立最終的測試參數(shù)。表1 顯示了不同BIOSTAT STR 袋子體積的最小可檢測裂縫尺寸。根據(jù)工程研究結(jié)果，建立了用于方法資質(zhì)認(rèn)可的最終測試參數(shù)（表2）。這些參數(shù)用于使用Sartocheck 4 plus 袋子測試儀為每種BIOSTAT STR 袋子體積設(shè)定一個測試程序.

方法驗(yàn)證確認(rèn)泄露測試結(jié)果的可靠性

在最終資質(zhì)研究過程中，不同袋子體積的最小可檢測裂縫尺寸通過測試具有統(tǒng)計(jì)顯著性數(shù)量的由不同日常生產(chǎn)批次中抽取的標(biāo)準(zhǔn)袋子所確定。所使用的分別為標(biāo)準(zhǔn)的、非改良的不同體積的袋子，和標(biāo)準(zhǔn)的、改良的具有一個缺陷補(bǔ)丁以代表最小可檢測裂縫尺寸的袋子。所有袋子均經(jīng)伽馬射線照射。每個袋子至少經(jīng)過10 組重復(fù)測試。表3 總結(jié)了資質(zhì)研究過程中無缺陷袋子所測得的最大壓力衰減值。所有測試袋子均顯示了預(yù)期的結(jié)果：無缺陷標(biāo)準(zhǔn)袋子通過了測試，而具有一個預(yù)備缺陷的標(biāo)準(zhǔn)袋子測試失敗。因此，使用壓力衰減法結(jié)合絨布的泄漏測試方法經(jīng)成功驗(yàn)證能夠防止裂縫的掩蓋，亦被證實(shí)為一種具有可預(yù)測性的穩(wěn)定可靠的方法，可用于日常操作中的泄漏檢測。

日常使用中快速有效的袋子泄漏測試方法

新型的一次性使用生物反應(yīng)袋泄漏測試方法是一種基于壓力衰減原理基礎(chǔ)上、結(jié)合一種特殊設(shè)計(jì)的多孔絨布，且經(jīng)驗(yàn)證的測試方法，可用于一次性使用袋子安裝后使用前的可靠且有效的泄漏測試。使用此種新穎的測試方法，一次性使用生物反應(yīng)器可獲得同等級別的風(fēng)險控制以及操作程序的保障。

壓力衰減方法在日常操作中也比較容易實(shí)施。自動化測試程序和用戶指南大大降低了操作員手動失誤的風(fēng)險。在整個測試過程中環(huán)境溫度的監(jiān)測則進(jìn)一步加強(qiáng)了測試結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，同時也防止了測試結(jié)果發(fā)生錯誤性合格和錯誤性不合格的假象，該設(shè)備既穩(wěn)固又經(jīng)濟(jì)。

節(jié)約一個批次的產(chǎn)品，便是快速收回投資回報的一次機(jī)會。泄漏測試可有效降低發(fā)生生產(chǎn)計(jì)劃改變和項(xiàng)目延誤而造成的風(fēng)險，尤其是在生物安全性極為關(guān)鍵的生物制品生產(chǎn)工藝（比
如：疫苗生產(chǎn)）中，同時這更是保護(hù)操作員安全的一個不可或缺的工具。