BioTNT mRNA 引物篩選，引物定制或specific primers的使用說明書
版本號：20100001
BioTNT qPCR Primer Assay for specific mRNA genes
目錄號：SER-PCR –編號（500T）;
說明書 Part A
一、產(chǎn)品簡介：
本試劑盒是基于最可靠的SYBR® Green-based定量real-time PCR試劑盒并應(yīng)用基因表達(dá)分析。
我們的實驗為基因特異性定量PCR驗證具有統(tǒng)一、高效和標(biāo)準(zhǔn)化特點的擴增反應(yīng)條件。
每一對引物都是經(jīng)過嚴(yán)格的實驗驗證的。
已經(jīng)使用適當(dāng)?shù)膔eal time PCR Mix的時候，合適的片段大小和高的擴增效率成為保證。
qRT-PCR Primer pair kits統(tǒng)一的擴增效率和條件為熒光定量pcr實驗中多基因表達(dá)的檢測提供了準(zhǔn)確而靈活的解決方案。
完整的試劑盒說明書由part A 和Part B構(gòu)成。Part A 主要描述了本試劑盒的使用方法和注意事項，Part B主要注明了assay 的特異情況。
二、產(chǎn)品特點：
本產(chǎn)品適用于有一定q PCR實驗經(jīng)驗的客戶或者無經(jīng)驗的客戶在公司的技術(shù)指導(dǎo)下進行。
三、保存條件：
可在常溫下運輸。常期保存請在-20℃保存，效期12個月。
警告：本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于醫(yī)藥、臨床治療、食品及化妝品等其他用途。
安全提示：本產(chǎn)品中部分試劑有腐蝕性或毒性，請勿直接接觸皮膚或吞咽；操作時請穿戴實驗服、防護鏡和手套；如果接觸皮膚，應(yīng)立即用洗滌劑和大量清水沖洗；誤食或其他危急情況，請及時到醫(yī)院就治；部分試劑易燃，請注意消防安全。
四、注意事項：
請在收到此試劑盒后立刻檢查試劑盒組成，BioTNT 公司只負(fù)責(zé)受理在試劑盒簽收后三個工作日內(nèi)的試劑缺失報告；
五、試劑盒組成：
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試 劑
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說 明
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T
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qPCR上游引物
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10×
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1ml （500T）
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qPCR下游引物
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10×
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1ml （500T）
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其他特點請參照Part B。
六、保證結(jié)果可使用的qPCR試劑：
BioTNT real time PCR Premix 貨號：A2010A0112
七、其他需要自己準(zhǔn)備的：
1、 耗材：0.5 mL或1.5mL Eppendorf管（無菌、無酶、RNase-free；貨號），Tips(RNase-free)（1000μL、200μL、10μL的槍頭；）；
2、 檢測的樣本CDNA；
3、 無菌無酶的 PCR 水（貨號：A2010B0X03）；
4、 離心機；移液器（10μL ，200μL，1000μL）；
5、 手套，口罩。
八、預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾個方面：
1、 經(jīng)常更換新手套，以防止RNase污染；
2、 使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染；
3、 RNA在Rrizol試劑中時短時間內(nèi)不會被RNase降解，但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料或玻璃器皿（玻璃器皿可在150℃燒烤4小時，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用DEPC水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase）；
4、 配制溶液應(yīng)使用RNase-free ddH2O（貨號：A2010B0X03）
九、操作步驟：
1、 請混勻所有的試劑（15秒）；
2、 請按以下配比對每個反應(yīng)配20μL的體系：
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反應(yīng)液組份
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用于熒光PCR實驗
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加量 (μL)
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終濃度
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備注
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Real time PCR Premix試劑混合物
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10
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1×
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貨號：
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上游引物（10×）
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2
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1×
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下游引物（10×）
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2
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1×
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待檢DNA樣品
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1
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用戶提供*
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PCR水
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5
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總體積
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20
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*注意：如果您的cDNA模板不是使用BioTNT的cDNA第一鏈合成試劑盒（貨號：A2010B0B01，A2010B0B02）進行逆轉(zhuǎn)錄合成的，請適當(dāng)?shù)恼{(diào)整cDNA的用量（1-6μL），調(diào)整無菌去離子水的用量，使總體積保持20μL；
*注意：如果您不使用BioTNT real time PCR Premix，請做引物濃度梯度實驗，以使實驗達(dá)到最佳效果；
*注意：建議MIX引物、標(biāo)本與PCR水預(yù)混，在實驗操作中盡量避免使用移液器的最小量程，盡量減少加樣次數(shù)，以減少因加樣而導(dǎo)致的誤差。在操作中，應(yīng)使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套(經(jīng)常替換)、移液器頭(帶濾嘴自卸式)，不能用手直接觸摸PCR反應(yīng)管/條/板。
*注意：如果使用其他體積的體系（5-50μl），應(yīng)保證終濃度與說明書上的終濃度一致。配制反應(yīng)體系時，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進行，不能用移液器吹打，避免產(chǎn)生氣泡。如果產(chǎn)生氣泡，請用手指將氣泡彈破，再低速離心。反應(yīng)體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，立即進行PCR擴增。
*大多數(shù)儀器建議采用20ul體系；Roche的lightcycler 和ABI 7900，stepone plus，viia7 等可以采用10ul體系；
*建議每個樣本同一個基因做雙重復(fù)或者三重復(fù)；
*設(shè)立陰性對照(即加樣品的時候用水來代替);
*建議購買BioTNT 的陽性對照( 貨號: A2010B0X10 ); 并在實驗中設(shè)立陽性對照;
1、 低速離心數(shù)秒，并且按照熒光PCR儀的使用說明放置好您的PCR管/條/板；
2、 從下列表中選擇最合適的實驗反應(yīng)條件，按照熒光PCR儀的使用說明設(shè)置好PCR反應(yīng)條件：
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熒光PCR儀
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循 環(huán)
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時 間
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溫 度
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ABI: 5700, 7000, 7300, 7500, 7700, 7900HT, StepOnePlus
BioRad: iCycler®, iQ5, MyIQ
Stratagene: Mx3000p, Mx3005p, Mx4000p
Eppendorf: Mastercycler® ep realplex
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1
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5 minutes [1]
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95℃
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40
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15 seconds
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95℃
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1 minute [2]
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60℃
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Roche*: LightCycler 480®
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1
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5 minutes [1]
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95℃
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45
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15 seconds
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95℃
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1 minute [2]
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60℃
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*注意羅氏LightCycler 480 ®用戶：請調(diào)整升溫速率為1℃/秒。更多關(guān)于其他所需的改變和熔融曲線設(shè)置的信息請參閱儀器安裝指南。
3、下列儀器使用三個步驟的循環(huán)程序：
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熒光PCR儀
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循 環(huán)
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時 間
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溫 度
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BioRad: CFX96, CFX384, Opticon,
Opticon 2, Chromo 4 (MJ Research)
Takara: TP-800
All other instruments
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1
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5 minutes [1]
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95℃
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40
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15 seconds
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95℃
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20 到30 seconds
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60℃
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30 seconds [2、3]
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72℃
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[1]95℃ 5分鐘的步驟是為了激活熱啟動DNA聚合酶。
[2]檢測并記錄熒光染料熒光信號在每個周期的延伸結(jié)束時。
[3]不同的儀器需要檢測熒光信號的時間長短不同，請根據(jù)您的儀器選擇適當(dāng)?shù)难由鞎r間。
反應(yīng)條件示例：95℃ 5分鐘→95℃ 15秒→60℃ 30秒（讀板）→溶解曲線分析；
40個循環(huán)
注：以上反應(yīng)條件是應(yīng)用BioTNT 染料法premix（貨號：A2010A0112），在ABI stepone plus上的反應(yīng)條件。請注意，第一步95℃ 5分鐘 是BioTNT premix的hot start的特點，如使用其他公司的premix，請調(diào)整這一步的反應(yīng)時間。
十、實驗結(jié)果判斷:
i.陽性對照(或者客戶的陽性模板)的內(nèi)參基因的熔解曲線呈單峰，其Tm與引物說明書上的產(chǎn)物Tm相近；擴增曲線呈S型； 雙重復(fù)重復(fù)良好（Ct值相差不超過1），說明加樣誤差和儀器誤差比較小，可用；如果 CT相差超過1.5，該數(shù)據(jù)不可用，需要重新檢測；
ii.陰性孔Ct＞33，熔解曲線在目的產(chǎn)物或內(nèi)參產(chǎn)物峰處無明顯特異性產(chǎn)物峰出現(xiàn)，說明實驗體系無污染，數(shù)據(jù)可信；
iii.內(nèi)參實驗的CT值在15-25之間，可根據(jù)文獻(xiàn)來確定內(nèi)參基因CT應(yīng)該在的區(qū)域，來進行數(shù)據(jù)判斷，抽提和逆轉(zhuǎn)錄的可靠性；
iv.其他情況請參考實驗疑難分析與解答或咨詢公司技術(shù)人員。
十一：內(nèi)參基因的選擇：
1、對照組和實驗組的內(nèi)參基因，盡量少受實驗干預(yù)的影響；可以進行多個內(nèi)參基因的比較，選擇較少受實驗干預(yù)影響的內(nèi)參基因；
2、請選擇與目的基因CT比較接近的內(nèi)參基因，來作為實驗的內(nèi)參基因，進行均一化處理。
十二、Trouble shooting
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問題
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解決
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樣本沒有擴增曲線
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查看儀器設(shè)置，是否設(shè)置正確的熒光讀板時間，不同機器有不同的讀板方式；即使沒有擴增，也會有熒光檢測曲線；ABI 機器在部分錯誤設(shè)置時，不能顯示正確的擴增曲線；ABI機器可以查看儀器的原始熒光信號；
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樣本沒有熔解曲線
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查看熔解曲線設(shè)置是否正確；
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雜亂的熔解曲線
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可能沒有產(chǎn)物；查看BioTNT microRNA assay提供的陽性CDNA對照進行real time PCR 擴增結(jié)果如何；
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熔解曲線峰與BioTNT microRNA assay 中提供的tm 值不一致
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與公司的技術(shù)部聯(lián)系
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陰性對照有擴增曲線，且熔解曲線峰與目的產(chǎn)物峰相同
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被污染，注意加樣和PCR的防污染措施
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相關(guān)的產(chǎn)品：
1、 Trizol法總RNA提取試劑盒，貨號： A2010B0A01（20T）， A2010B0A02（50T），A2010B0A03（100T）；
2、 cDNA第一鏈合成試劑盒，貨號：A2010B0B01（50T），A2010B0B02（100T）；
3、 real time PCR Premix試劑盒，貨號： A2010A0112；
4、 目的基因陽性對照，貨號：A2010B0X10；
5、 內(nèi)參基因real time PCR primer pairs，貨號：A2010AH001 （500T）; A2010AM001 （500T）; A2010AR001 （500T）；
品質(zhì)保證：
所有產(chǎn)品由BioTNT 進行品質(zhì)保證。
如果客戶使用中有任何問題，都可以聯(lián)系BioTNT公司。
標(biāo)簽：
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