鹽酸莫西沙星注射液中雜質(zhì)的檢測及結(jié)構(gòu)鑒定

鹽酸莫西沙星注射液中雜質(zhì)的檢測及結(jié)構(gòu)鑒定

王志英
沃特世科技(上海)有限公司

前言：

莫西沙星(Moxifloxacin)為人工合成的喹諾酮類抗菌藥，是一類較新的合成抗菌藥。具有抗菌性強、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性，并對常見耐藥菌有效、半 衰 期 長、不良 反 應(yīng) 少 等 優(yōu) 點。臨 床 上 用 于 治 療 呼 吸 系 統(tǒng) 感 染 、生 殖系統(tǒng)感染、皮膚軟組織感染等。莫西沙星原研廠家為德國拜耳，其注射劑在中國的專利保護期即將到期，國內(nèi)也有多個廠家正在進行莫西沙星的仿制。但如今基于藥品安全的考慮，仿制藥中的有關(guān)物質(zhì)的檢測越發(fā)引起注意，中國藥典上也明確規(guī)定，藥物中雜質(zhì)，含量高于0.1%的所有雜質(zhì)均需對其雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進行鑒別(毒性藥物限度則更低)。所 以 ，如 何 高 效 快 速 地 測定藥物中的雜質(zhì)，這一課題逐漸成為藥物研究過程中亟待解決的難點。

本文采用沃特世(Waters®)超高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜(ACQUITY UPLC/Xevo G2-S QTof)聯(lián)用技術(shù)對莫西沙星注射液(光照10天)樣品中雜質(zhì)進行分析,采用亞2  µm色譜柱UPLC方 法 ，使 整 個 分 離 時 間 由60分鐘縮短至25分鐘 ，且 雜 質(zhì) 得 到 有 效 分 離 ；應(yīng) 用MassLynx和MetaboLynx軟 件 ，自 動 得 到 包 含各個雜質(zhì)分子量、分子式、及結(jié)構(gòu)信息的雜質(zhì)列表，使整個雜質(zhì)鑒定過程高效快速、節(jié)省人力。

實驗條件：

實驗流程：

 圖6. 主峰的一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖

采用MassLynx軟件，通過準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)和同位素匹配確定分子式，之后再根據(jù)二級碎片質(zhì)譜對結(jié)構(gòu)進行確認。以主峰為例說明判斷分子式的過程，如圖7確認分子式。再通過軟件MassFragment功能對二級碎片進行自動解析，如圖8，可看出，其碎片的精確度也非常好，質(zhì)量偏差很小。

圖7. 通過準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)和同位素分布來確定分子式(以主峰為例）

圖8. 通過準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)和同位素分布來確定分子式

使用MetaboLynx對雜質(zhì)進行自動解析，其解析結(jié)果界面如圖9，可以自動得到雜質(zhì)列表，其中包含分子量、分子式、質(zhì)量偏差、峰面積及其結(jié)構(gòu)信息。軟件還自動顯示每個雜質(zhì)在樣品中的提取離子流圖、在空白中的提取離子流圖、一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖，使雜質(zhì)的分析更明確。通過此軟件可快速得到其整個樣品譜圖上所有雜質(zhì)的信息，具體如圖10顯示。其中從“質(zhì)量偏差(mDa)”可看出由Xevo G2-S QTof可獲得很好的質(zhì)量精度，其質(zhì)量偏差在0.8 mDa以內(nèi)。“雜質(zhì)與母藥關(guān)系”一欄，可快速獲得其結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息。如寫“Hydroxylation”即“主峰的結(jié)構(gòu)+O”，“Hydroxylation + desaturation ”即“主峰的結(jié)構(gòu)+O-H2”。另外出現(xiàn)如(R_0:-CH2)等“R_”的形式是指軟件自動對主峰進行烷基化斷裂后的結(jié)構(gòu)(軟件已自動給出結(jié)構(gòu))，如“Hydration-CH2 (R_0:-CH2)”即指“主峰-CH2后的結(jié)構(gòu)再+H2O-CH2”，其結(jié)構(gòu)也已呼之欲出。

圖9. MetaboLynx對雜質(zhì)進行自動解析的界面

圖10. 通過軟件自動得到的莫西沙星注射液(光照10天)樣品雜質(zhì)列表，包含雜質(zhì)峰m/z、保留時
間、分子量、分子式、質(zhì)量偏差、峰面積及具體的結(jié)構(gòu)信息等

客戶特別關(guān)心的三個大峰紫外譜圖中5.93 min、8.60 min、18.68 min的雜質(zhì)信息如表2。其中5.93 min和8.60 min的峰包含有多個雜質(zhì)，未完全分開。從圖11中，RT 5.93 min的一級質(zhì)譜圖可看出：m/z 187.5981為帶了雙電荷的分子離子，與m/z 374.1880為同一化合物,且m/z 374.1880的含量較高。圖12可以看出，200.5981為帶了雙電荷的分子離子，與400.1866為同一化合物，此雜質(zhì)濃度較高。圖11、12、13分別列出了這三個色譜峰的一級質(zhì)譜圖、每個雜質(zhì)組分的二級質(zhì)譜圖及可能的結(jié)構(gòu)。

圖11. 紫外譜圖中RT 5.93 min峰包含的雜質(zhì)一級及二級質(zhì)譜圖及可能結(jié)構(gòu)

圖12. 紫外譜圖中RT 8.60 min峰包含的雜質(zhì)一級及二級質(zhì)譜圖及可能結(jié)構(gòu)

圖13. 紫外譜圖中RT 18.68 min峰包含的雜質(zhì)一級及二級質(zhì)譜圖及可能結(jié)構(gòu)

結(jié)論：

本實驗將常規(guī)HPLC色譜柱檢測方法平行轉(zhuǎn)化為亞2 μm的UPLC色譜柱檢測，分析時間由60 min縮短至25 min，大大提高分析效率，同時流速由1 mL/min降至0.45 mL/min，節(jié)約了溶劑成本。分離度及出峰情況與原譜圖保持一致。應(yīng)用Xevo G2-S QTof能得到最準(zhǔn)確的分子量,其雜質(zhì)質(zhì)量偏差在0.8 mDa以內(nèi)，同時利用MeteboLynx智能軟件，快速得到包含所有雜質(zhì)峰m/z、保留時間、分子量、分子式、質(zhì)量偏差、峰面積及具體結(jié)構(gòu)信息的雜質(zhì)列表，提取離子流圖、一級和二級質(zhì)譜圖等信息，大大節(jié)省人力及時間。通過此雜質(zhì)列表及質(zhì)譜圖可得到雜質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)，再通過MassFragment功能對雜質(zhì)二級碎片結(jié)構(gòu)進行匹配進而確定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。從此推斷流程可看出，在高效的UPLC、精準(zhǔn)的QTof儀器及強大的智能軟件幫助下，復(fù)雜的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定工作變得更簡單輕松，對人員的經(jīng)驗、資歷背景依賴性降低，大大節(jié)省人力、物力和時間成本，對于藥物的有關(guān)物質(zhì)研究工作起到積極的推動作用。