TA克隆常見問題及解決方案

TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片斷與一個具有3-T突出的載體DNA連接起來的方法。因為PCR反應(yīng)中所適用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移的活性，通常在3加上A。例如：Taq聚合酶同時具有的末端連接酶的功能，PCR反應(yīng)時在每條PCR擴增產(chǎn)物的3端自動添加一個3-A突出端。只有用經(jīng)過特殊處理的具有3-T突出末端的DNA片斷才能通過T/A配對進行連接。通過PCR的方法擴增目的基因片斷的過程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，獲得的目的片斷通常需要通過TA克隆的方法，重組到T-載體中，通過序列測定清楚DNA序列。

 

由于在PCR過程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分為2種情況：（1）使用不同的Taq酶，在PCR擴增循環(huán)結(jié)束后，加上72℃ 10分鐘一個過程，Taq酶可以在擴增產(chǎn)物的3末端加上A，因此PCR產(chǎn)物回收純化后可以和T載體直接連接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在擴增產(chǎn)物的3末端加上A，得到的DNA序列為鈍端，因此，需要在回收純化后進行加A的過程，通常是以PCR回收產(chǎn)物為模板，加上一定量的普通Taq酶和反應(yīng)液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分鐘，然后將加A產(chǎn)物直接用于TA連接。