使用Ostro樣品制備產(chǎn)品從血漿中提取磷脂

使用Ostro樣品制備產(chǎn)品從血漿中提取磷脂

Mark Ritchie，Mainak Mal和Stephen Wong
沃特世公司，新加坡

簡介：

多數(shù)“組學(xué)”研究的共同目標(biāo)是鑒定疾病分子標(biāo)記物、理解疾病作用機(jī)理，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶點(diǎn)。通常情況下，用于研究的體液因?yàn)榕c活體器官和組織密切接觸所以其對身體病理狀態(tài)特定反應(yīng)非常靈敏。在脂質(zhì)組學(xué)分析中，通常采用液液提取的方式對血漿的磷脂進(jìn)行研究。過去也曾有固相萃取的應(yīng)用。氨丙基硅膠柱也可用于分析脂質(zhì)，但多著重于脂肪酸，或是會根據(jù)洗脫條件的不同進(jìn)行篩選。Ostro 96孔樣品制備板則針對日常生物分析中的小分子進(jìn)行研究，捕獲并去除樣本制備過程中大量的磷脂成分。在該通用流程中，脂質(zhì)保留在Ostro板上，并不進(jìn)行洗脫。對上樣和洗脫條件進(jìn)行調(diào)整，就能實(shí)現(xiàn)選擇性富集特定類型磷脂或萃取全部磷脂。

實(shí)驗(yàn)條件：

樣品制備：

人血漿樣本來源：新加坡國立大學(xué)生物科學(xué)中心志愿者，或商業(yè)樣本（Sigma，P/N P9523）。

萃取流程：

1. 將Ostro板放置在2 mL收集板上，并安置在真空裝置上。
2. 使用移液管將100 μL血漿直接上樣到Ostro板中。
3. 在孔中加入800 μL乙醇，使用移液管抽吸10次，確保樣本充分混合。
4. 混合過后，應(yīng)用15˝ Hg真空條件，直至溶劑完全排空（約1分鐘）。
如在15˝ Hg條件下沒有流出液體，可采用更高的真空條件。
5. 重復(fù)步驟3和4，并將收集到的流量標(biāo)記為“流穿”部分。
6. 從真空裝置中移除含有流穿部分的收集板，并重新安裝新板用于收集洗脫部分。
7. 加入800 μL洗脫溶劑（4.5:4.5:1/氯仿：甲醇：三乙胺）至孔中。
8. 應(yīng)用15˝ Hg真空條件、直至溶劑完全排空（約1分鐘）。
9. 重復(fù)步驟6和7，并將收集到的容量標(biāo)記為“洗脫”部分。
10. 對流穿和洗脫部分進(jìn)行干燥（使用氮蒸發(fā)器，約1.5小時）。
11. 用200 μL 1:1（v/v）氯仿：甲醇復(fù)溶洗脫（E）和流穿（FT）部分。

注：請小心確保槍頭被放置在樣本板的指定位置，避免樣本流失或混合。

為便于比較，等量相同的人血漿使用Bligh-Dyer法1 進(jìn)行萃取。鑒于不同的磷脂種類之間動態(tài)差異范圍極大，我們分析了兩種濃度的樣本：未經(jīng)稀釋的、用乙腈按照1/100比例稀釋的。采用帶有正負(fù)切換的多反應(yīng)監(jiān)測方法，多反應(yīng)監(jiān)測時間設(shè)定與特定類型磷脂1 的洗脫時間吻合。該方法的簡要介紹如表1所示。

采用預(yù)編程TargetLynx™方法對每種成分得到的信號自動積分。平均峰面積閾值設(shè)定為1000。

即將分析前，在樣本中加入外源性脂類內(nèi)標(biāo)作為空白對照，比較兩種樣本制備方法。該步驟是為了在計算方法或洗脫成分的相對提取率之前對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。加入的脂類及濃度如表2所示。

結(jié)果與討論：

對比使用Ostro樣品制備和Bligh-Dyer方法的萃取率

將混合的志愿者血漿進(jìn)行萃取，每種兩份。因峰面積閾值設(shè)定為1000，為檢測脂類，MRM通道的峰面積至少要大于這一閾值。采用與后提取加標(biāo)的同類型外源性磷脂的比率對每種脂類的峰面積值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作。隨后，綜合同一方法的同一萃取液對這些比率計算平均分配值，使每個部分的脂類都能獲得唯一的標(biāo)準(zhǔn)值。隨后得出的Ostro流穿部分和洗脫部分的脂類數(shù)值去除以用相同脂類由Bligh-Dyer方法得出的數(shù)據(jù)，得到的結(jié)果就是每種脂類的萃取率。每種脂類的平均萃取率如表3所示。

鞘磷脂（SMs）、磷脂酰膽堿（PCs）和溶血磷脂酰膽堿（LPCs）都通過Ostro板完全保留，僅在洗脫液中出現(xiàn)。同種磷脂在兩種萃取方法中強(qiáng)度相同。

神經(jīng)酰胺（Cer）和磷脂酰甘油（PGs）則在相同條件下幾乎無親和力，主要在流穿部分中出現(xiàn)，只有非常少一部分被保留，并出現(xiàn)在洗脫部分。定性相同PG脂類，使用Ostro板的萃取率與Blgih-Dyer法相比，其峰面積更大。磷脂酰乙醇胺（PEs）和磷脂酰肌醇（PIs）表現(xiàn)一致，其萃取率在Ostro板上和Bligh-Dyer法一致，但在Ostro板上保留更強(qiáng)，在洗脫液中的含量略高。相同的溶血PE（LPE）類在兩種萃取方法中都有發(fā)現(xiàn)，但使用Ostro板得到的回收率只有Bligh-Dyer法的60%。另一方面，使用Ostro樣品制備則大大促進(jìn)了溶血磷脂酰肌醇（LPIs）的萃取率，使用Ostro板比使用Bligh-Dyer法多觀測到5種脂類種類。多數(shù)LPI（90%）都沒有在Ostro板上保留�？傮w來說SMs、PCs和LPCs都能在Ostro板上進(jìn)行保留，且洗脫溶液僅能為氯仿：甲醇：三乙胺（4.5:4.5:1）。其他類型磷脂在該條件下均不與板發(fā)生明顯保留作用，通過板并出現(xiàn)在流穿部分。

Ostro磷脂萃取方法的重復(fù)性

使用Ostro萃取市售人血漿的14份樣本。分析每種磷脂三份提取物樣本在流穿（FT）和洗脫（E）部分中的情況。計算每種脂類在所有復(fù)本中峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差百分比（%RSDs），如表4所示。

如上所示的%RSD受離子強(qiáng)度影響，較少的類型卻在本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生了更多的誤差。相同閾值的情況下5，分析（LC-MS）方法的誤差在5%以內(nèi)。

結(jié)論：

用于磷脂提取的Ostro樣品制備方法簡單且重復(fù)性好。使用這種方法在血漿中檢測到的磷脂種類數(shù)目和數(shù)量相比標(biāo)準(zhǔn)萃取方法（Bligh-Dyer）更好，Ostro板在LPIs和PGs的回收方面具備明顯優(yōu)勢。該方法適用于小型和大型脂質(zhì)組學(xué)研究。鑒于Ostro板采用96孔式、無需離心，它也能被應(yīng)用于通過液液萃取無法實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)室自動化。相比液液萃取法，Ostro樣品制備法同時顯著降低了溶劑用量。該方法既能普遍應(yīng)用于全部磷脂的萃取，亦可選擇性地萃取特定種類磷脂。例如，對流穿部分進(jìn)行分析，可以研究含量較低的部分種類磷脂，而不會受到含量過大的PCs的線性范圍或者離子抑制作用的影響。

1. Bligh, E.G and Dyer, W.J.; Canad.J. Biochem. Physiol (1959) 27, 911-917
2. Zhao, Z and Xu, Y; J. Lipid Res (2010) 51, 652-659
3. Burdge et al.; British Journal of Nutrition (2000), 84, 781-787
4. Kim et al.; J. Lipid Res (1990), 31, 2285-2289
5. UPLC BEH HILIC: “T he Preferred Separation Chemistry for Targeted Analysis of
Phospholipids”, Mark Ritchie, Mainak Mal, and Stephen Wong. Waters Application Note
no. 720004219EN, January 2012.