ELISA試劑盒的選擇
醫(yī)藥研發(fā)人員，尤其是各大醫(yī)藥研發(fā)公司的動物模型，臨床實驗的研究人員在實驗設(shè)計中，需要選擇一些有疾病代表性的Biomarker，比如在特定適應(yīng)癥的臨床實驗中的使用率，學術(shù)文章中的發(fā)表情況。如能有效掌握一些大數(shù)據(jù)，將給實驗設(shè)計的合理性提供了保證。
第一步：測什么Biomarker？
可以根據(jù)研究文獻的數(shù)量和臨床試驗，比如TNF-a，在以下各大疾病的臨床實驗中，和對應(yīng)文獻中均有使用。當然在炎癥，心血管疾病，糖尿病等疾病中的臨床試驗和使用最多。
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TNF-a在疾病中的應(yīng)用(數(shù)據(jù)僅供參考)
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臨床實驗
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文獻數(shù)量
|
|
急性冠脈綜合征
|
2
|
27
|
|
急性腎損傷
|
1
|
10
|
|
與年齡相關(guān)的記憶障礙
|
1
|
1
|
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alpha - 1抗胰蛋白酶缺乏癥
|
1
|
-
|
|
老年癡呆癥病
|
1
|
5
|
|
類風濕關(guān)節(jié)炎
|
1
|
135
|
|
雙相情感障礙
|
1
|
-
|
|
癌癥,肛
|
1
|
-
|
|
癌、乳腺癌
|
3
|
30
|
|
癌、前列腺癌
|
1
|
15
|
|
心血管疾病
|
4
|
418
|
|
慢性腎臟疾病
|
3
|
37
|
|
慢性阻塞性肺疾病
|
3
|
23
|
|
常見的變量免疫缺陷
|
1
|
1
|
|
充血性心力衰竭
|
3
|
77
|
|
冠狀動脈疾病
|
7
|
112
|
|
囊性纖維化
|
2
|
6
|
|
抑郁
|
1
|
24
|
|
糖尿病
|
9
|
100
|
|
杜氏肌營養(yǎng)不良癥
|
1
|
-
|
|
移植物與宿主疾病
|
1
|
11
|
|
hemophagocyticlymphohistiocytosis
|
1
|
-
|
|
肝細胞癌
|
1
|
6
|
|
艾滋病毒感染
|
5
|
50
|
|
高血壓
|
1
|
39
|
|
炎癥
|
17
|
711
|
|
間質(zhì)性膀胱炎
|
1
|
-
|
|
肝硬化
|
1
|
14
|
|
肝衰竭
|
1
|
8
|
|
多發(fā)性硬化癥
|
1
|
32
|
|
肥胖
|
8
|
104
|
|
骨關(guān)節(jié)炎
|
1
|
11
|
|
骨質(zhì)疏松癥
|
1
|
24
|
|
胰腺炎
|
1
|
6
|
|
牙周炎
|
1
|
13
|
|
牛皮癬
|
2
|
48
|
|
呼吸窘迫綜合征
|
2
|
9
|
|
硬皮病
|
1
|
3
|
|
鐮狀細胞病
|
2
|
4
|
|
鼻竇炎
|
1
|
1
|
|
中風
|
1
|
46
|
|
蛛網(wǎng)膜下腔出血
|
1
|
-
|
|
緊張型頭痛
|
1
|
-
|
|
創(chuàng)傷
|
1
|
-
|
|
潰瘍性結(jié)腸炎
|
3
|
13
|
|
血管炎
|
1
|
21
|
第二步：選什么試劑盒？
以TNF-a為例，Meso Scale Discovery® Vplex電化學發(fā)光試劑盒以0.04pg/mL的靈敏度是普通ELISA（7 pg/mL左右）的100多倍。如果實驗樣本中的TNF-a低于7pg/mL,這就意味著實驗數(shù)據(jù)會無法檢測，實驗沒有定量結(jié)論。另外一個案例，臨床常規(guī)測定普通CRP的方法檢測線性一般為3~200mg/L，而預(yù)測心血管事需要更高靈敏度的CRP，超敏或高敏CRP （hs-CRP）。
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類型
|
指標（Human）
|
靈敏度（pg/mL）
|
提升靈敏度（倍）
|
|
|
超敏Vplex
|
普通ELISA
|
|||
|
炎癥因子
|
IFN-g
|
0.2
|
8
|
40
|
|
IL-1b
|
0.04
|
1
|
25
|
|
|
IL-2
|
0.09
|
7
|
78
|
|
|
IL-4
|
0.02
|
10
|
500
|
|
|
IL-6
|
0.06
|
0.6
|
10
|
|
|
IL-8
|
0.04
|
7.5
|
188
|
|
|
IL-10
|
0.03
|
3.9
|
130
|
|
|
IL-12p70
|
0.11
|
5
|
45
|
|
|
IL-13
|
0.24
|
57.4
|
239
|
|
|
TNF-a
|
0.04
|
7.1
|
178
|
|
|
細胞因子
|
GM-CSF
|
0.14
|
3
|
21
|
|
IL-1a
|
0.09
|
1
|
11
|
|
|
IL-5
|
0.22
|
2
|
9
|
|
|
IL-7
|
0.16
|
5
|
31
|
|
|
IL-12/IL23p40
|
0.39
|
15
|
38
|
|
|
IL-15
|
0.17
|
2
|
12
|
|
|
IL-16
|
2.83
|
13.4
|
5
|
|
|
IL-17A
|
0.74
|
15
|
20
|
|
|
TNF-b
|
0.05
|
5.5
|
110
|
|
|
VEGF
|
1.12
|
9
|
8
|
|
|
趨化因子
|
Eotaxin
|
3.26
|
5
|
2
|
|
MIP-1b
|
0.37
|
10
|
27
|
|
|
Eotaxin-3
|
1.77
|
5.2
|
3
|
|
|
TARC
|
0.22
|
7
|
32
|
|
|
IP-10
|
0.37
|
4.46
|
12
|
|
|
MIP-1a
|
3.02
|
10
|
3
|
|
|
MCP-1
|
0.09
|
10
|
111
|
|
|
MDC
|
1.22
|
62.5
|
51
|
|
|
MCP-4
|
1.69
|
7.81
|
5
|
|
|
老年癡呆
|
Total Tau
|
1.07
|
12
|
11
|
|
Abeta40
|
5.41
|
100
|
18
|
|
|
Abeta42
|
0.516
|
100
|
194
|
|
|
血管生成
|
VEGF-C
|
11.1
|
48.4
|
4
|
|
VEGF-D
|
2.53
|
31.3
|
12
|
|
|
Tie-2
|
21.1
|
66
|
3
|
|
|
Flt-1
|
0.56
|
13.3
|
24
|
|
|
PIGF
|
0.32
|
7
|
22
|
|
|
bFGF
|
0.08
|
3
|
38
|
|
|
血管創(chuàng)傷
|
SAA
|
10.9
|
368
|
34
|
|
CRP
|
1.33
|
22
|
17
|
|
|
VCAM-1
|
6
|
1260
|
210
|
|
|
ICAM-1
|
1.03
|
254
|
247
|
|
第三步：檢測什么樣本？試驗周期多長？
如需要檢測的是尿液，檸檬酸鹽血漿樣本，需在訂購前仔細查看ELISA試劑盒說明書中的驗證樣本。簡單的說，如果ELISA試劑盒是沒有用過試劑盒檢測尿樣，檸檬酸鹽血漿，使用該試劑盒檢測尿樣會存在極大的風險；而且很多ELISA試劑盒中還會特別說明“不能檢測檸檬酸鹽血漿”。Vplex試劑盒驗證過的樣本有血清， EDTA血漿，肝素血漿，檸檬酸鹽血漿，尿液，細胞上清液。
如自己采購抗體，開發(fā)ELISA方法學，如遇到抗體親和力低，由于ELISA的兩次洗脫將可能將抗體洗掉，大大影響實驗結(jié)果。Meso Scale Discovery® 可以不用洗，2.5小時完成實驗的一步法。
如實驗研究周期較長，ELISA試劑盒盡量選擇一個批次的，以防止不同批次間的差異。然而由于普通ELISA有效期在3-12個月，而實驗周期往往在1-2年以上，一些長期臨床實驗項目甚至在5-10年，因而經(jīng)常面臨不同批次的挑戰(zhàn)。而Meso Scale Discovery®Vplex試劑盒經(jīng)過54個月穩(wěn)定性測試。使用Vplex，完全可以用一個批次支持2-3年的實驗。更多細節(jié)可以比較下表格：
|
|
Meso Scale Discovery®
超敏Vplex試劑盒
|
普通ELISA試劑盒
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試劑盒驗證過的樣本
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血清， EDTA血漿，肝素血漿，檸檬酸鹽血漿，尿液，細胞上清液
|
血清， EDTA血漿，肝素血漿，細胞上清液
|
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實驗流程
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可以免洗，無需洗板，2.5小時
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需要洗2次，6小時以上
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驗證
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靈敏度，準確度精確度，基質(zhì)效應(yīng)和不同類型樣本，特異性，54個月穩(wěn)定性測試
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靈敏度，準確度精確度，基質(zhì)效應(yīng)和不同類型樣本，特異性
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試劑盒檢測穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
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54個月穩(wěn)定性測試，3次凍融測試。
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無。有效期在3-12個月。
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校正數(shù)據(jù)
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使用NIBSC/WHO對照
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只有高端試劑盒才使用NIBSC/WHO對照
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正常人樣本數(shù)據(jù)檢測
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血清，EDTA血漿，肝素血漿，檸檬酸鹽血漿，尿液
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血清，EDTA血漿，肝素血漿
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LPS刺激樣本檢測
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全血樣本，PBMC（外周血單個核細胞），THP-1（人類單核巨噬細胞）
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無
|
美國Meso Scale Discovery(MSD)：成立于1995年，在2009年全球首次檢測到人攜帶甲型H1N1病毒，在2013年被評為“全球前五的免疫分析品牌”。其研發(fā)的基于微孔板的電化學發(fā)光檢測技術(shù)（簡稱：微孔板ECL ）是全面升級/替代ELISA， Western Blot，多蛋白因子檢測的第三代免疫分析技術(shù)。已經(jīng)廣泛被醫(yī)藥研發(fā)中心、藥物安全性評價中心、GLP實驗室、合同外包企業(yè)（CRO）、診斷、生物技術(shù)企業(yè)應(yīng)用于藥物篩選，動物模型，藥物代謝，血藥濃度，免疫原性，中和實驗，Biomarker篩選，抗體親和力，疫苗評估，宿主細胞殘留，診斷研究。
美國Meso Scale Discovery(MSD)部分應(yīng)用方向：
1、細胞因子研究：實現(xiàn)多因子研究，常規(guī)靈敏度達0.05pg/ml。符合GLP要求的多因子檢測。
2、信號通路研究：可實現(xiàn)同時檢測Phospho/Total磷酸化蛋白的研究，僅需4.5小時。
3、神經(jīng)退行性疾病研究：使用了腦脊液CSF等復(fù)雜基質(zhì)樣本檢測，無基質(zhì)效應(yīng)。
4、藥物安全性評估：符合FDA標準的高敏多指標檢測。
5、免疫原性評估：可兼容高達50ug/ml高濃度血藥干擾，達到<100ng/ml的ADA檢測靈敏度，符合FDA要求。
6、抗體亞型分型：快速鑒定樣本中不同亞型，可達0.1ng/ml的靈敏度水平
7、抗體表位分析：一次鑒定多達10種不同表位。
8、多價疫苗效價評估：縮短至1.5小時的評估流程。
9、抗體親和力測試：基于SET方法學的親和力測定，可分析高達10-15的親和力樣本。
10、中和抗體測定：基于細胞水平，更符合實際生物體要求。
11、細胞水平結(jié)合測試：Cell Base Binding測試，多達6log線性范圍，能夠鑒定細胞表面受體與對應(yīng)補體結(jié)合水平及親和力
12、生物工藝殘留測定：一次檢測，可鑒別多種宿主細胞以及純化工藝中的多種蛋白殘留測定，亞納克基本靈敏度，確保鑒定有效性。
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