利用沃特世Prep 150 LC系統(tǒng)分離銀杏葉中的黃酮類化合物

實(shí)驗(yàn)方案及色譜條件

點(diǎn)擊下載全部方案：

提取

將銀杏葉粉末(20 g)加入100 mL甲醇中，超聲60 min。加入40 mL 3N的鹽酸后，將此混合物加熱至沸騰并回流90 min。此回流操作可將黃酮苷水解成單個(gè)的黃酮化合物。冷卻至室溫后，使用Whatman #1濾紙對(duì)提取物進(jìn)行過濾即可，無需進(jìn)一步處理。

結(jié)果與討論

對(duì)制備所得的提取物進(jìn)行梯度UPLC^®分析，結(jié)果顯示其中槲皮素和山柰酚的濃度分別為0.088和0.104 mg/mL(未獲得異鼠李素的定量標(biāo)準(zhǔn)品)，根據(jù)UV (371 nm)條件下測(cè)得的峰面積百分比計(jì)算所得三種化合物的總體純度約為11%，14%和5%(圖3)。借助于先前開發(fā)出的分析級(jí)等度HPLC方法(圖4)，使用內(nèi)置于ChromScope軟件中的Analytical to Prep Gradient Calculator(分析級(jí)至制備級(jí)梯度計(jì)算器，圖5)可計(jì)算出幾何放大至內(nèi)徑為19 mm的色譜柱時(shí)所需的制備級(jí)分離流速。分析級(jí)至制備級(jí)梯度計(jì)算器是一款簡便且易用的工具，可進(jìn)行分析級(jí)至制備級(jí)操作的幾何縮放計(jì)算，提供流速與梯度時(shí)間計(jì)算信息。分析級(jí)方法到制備級(jí)方法的準(zhǔn)確放大可實(shí)現(xiàn)在分析級(jí)規(guī)模下進(jìn)行方法開發(fā)，從而能夠節(jié)省樣品并減少方法開發(fā)所需的溶劑使用量。放大的制備級(jí)色譜會(huì)與分析級(jí)色譜十分相似，使用戶能夠準(zhǔn)確地通過放大的制備級(jí)方法收集目標(biāo)峰。之前發(fā)布的應(yīng)用紀(jì)要3中對(duì)此類放大計(jì)算提供有更詳細(xì)的描述。

實(shí)驗(yàn)通過等度純化分離方法和基于閾值的餾分收集方法，使用0.25 mL的進(jìn)樣量實(shí)現(xiàn)了結(jié)果可接受的制備級(jí)分離(圖6)。通過ChromScope軟件可設(shè)置在收集時(shí)間段中通過閾值收集輕松實(shí)現(xiàn)各餾分的收集(圖7)。本示例中定義了一對(duì)收集時(shí)間段(3.0至4.0 min和6.0至7.5 min)，定義時(shí)間段以外洗脫出的所有峰都不會(huì)收集到最終的組分中。每個(gè)定義時(shí)間段中的洗脫峰必須滿足峰閾值條件(本示例中第一個(gè)時(shí)間段的閾值為25 mAU，第二個(gè)時(shí)間段閾值為15 mAU)
才能實(shí)現(xiàn)正確的收集操作。根據(jù)UPLC分析(數(shù)據(jù)未示出)，所收集餾分的純度分析顯示三種化合物的紫外吸收峰面積%純度分別為87%、96%和85%。

結(jié)論

■ 本實(shí)驗(yàn)采用沃特世Prep 150 LC制備級(jí)HPLC系統(tǒng)對(duì)銀杏葉粉末提取物中的物質(zhì)進(jìn)行了分離與純化。
■ 沃特世ChromScope軟件(1.4版)的全面化系統(tǒng)控制提供了出色的系統(tǒng)靈活性，用戶可對(duì)所有的方法參數(shù)進(jìn)行輕輕修改。
■ 實(shí)驗(yàn)先開發(fā)出了分析級(jí)分離方法，然后利用分析級(jí)至制備級(jí)梯度計(jì)算器將此方法幾何放大至Prep 150 LC系統(tǒng)上的19×100 mm制備級(jí)色譜柱。
■ 簡單易設(shè)置的餾分收集實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)化合物的精確收集。
■ 初始提取物中包含15%的槲皮素和18%的山柰酚，通過這套易于使用的Prep 150 LC系統(tǒng)可將每種組分的純度提高到87%以上。

參考文獻(xiàn)

1. PDR for Herbal Medicines, 4th Ed., 2007, Thompson Healthcare Inc,Montvale NJ, U.S.A.
2. Natural Products Isolation 2nd edition, edited by S.D. Sarker, Z. Latif, A.I.,2006 Humana Press Inc, Totowa, NJ, U.S.A.
3. “Analytical HPLC to Preparative HPLC: Scale Up Techniques usinga Natural Product Extract.” Andrew Aubin and Ronan Cleary.Waters Application Note 720003120en, 2009