Real-time PCR 數(shù)據(jù)導(dǎo)出 —— ABI儀器篇

1.      Real-time PCR數(shù)據(jù)：Real-time PCR完成后，所有數(shù)據(jù)并非可以直接導(dǎo)出，由于每一次實(shí)驗(yàn)的情況都不相同，儀器的很多默認(rèn)設(shè)定都會(huì)對(duì)最終數(shù)據(jù)結(jié)果造成重大偏差，所以在完成PCR過程后，需要人為對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行條件設(shè)置，才能提取到科學(xué)有效的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)而完成對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和判斷。

 

2.      數(shù)據(jù)導(dǎo)出調(diào)整步驟：a調(diào)整參比熒光選項(xiàng)；b調(diào)整基線；c調(diào)整閾值

 

3.      概念：

 

a.參比熒光（dye as the passive reference）：參比熒光的作用是用來消除光程差，調(diào)整擴(kuò)增曲線線形和溶解曲線峰形，與PCR反應(yīng)所加熒光染料mix相關(guān)，不同公司品牌的mix所含參比熒光的種類不一樣，如：Takara選用ROX，ABI則沒有參比熒光，數(shù)據(jù)提取時(shí)，需注意下參比熒光選項(xiàng)，如選錯(cuò)，擴(kuò)增曲線或溶解曲線或?qū)�無法正確呈現(xiàn)。

 

b.基線（Baseline）：是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大。接近一條直線，這樣的直線即是基線�；�線調(diào)整包括基線起點(diǎn)與基線重點(diǎn)，起點(diǎn)一般設(shè)在2-3個(gè)CT，終點(diǎn)設(shè)在擴(kuò)增曲線開始上揚(yáng)即進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的CT值前2-3個(gè)CT，終點(diǎn)設(shè)置太靠前會(huì)降低CT值，太靠后則會(huì)增加CT值。如儀器默認(rèn)基線期與上述基準(zhǔn)不一致，很可能需要人為設(shè)定調(diào)整。

 

c.熒光域值（threshold）：一般儀器會(huì)將PCR 反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)（即基線期）的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值默認(rèn)是PCR 3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，正確的熒光域值應(yīng)設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期循環(huán)數(shù)。

 

4.      StepOne參比熒光: 在plate setup中選擇和設(shè)置參比熒光

5. StepOne基線（Baseline）：選中Analysis Setting按鈕，出現(xiàn)如下對(duì)話框

•    選中Advanced Setting選項(xiàng)，將每個(gè)差別大Baseline End值調(diào)到正確數(shù)值。

•    最后點(diǎn)擊Apply Analysis Setting按鈕

•    左圖調(diào)整前基線微上翹，有圖調(diào)整后基線平整

 

•    6. StepOne閾值（Threshold）：選中孔板中所有的數(shù)值，如下界面選擇log、Target對(duì)話框

•    將每個(gè)基因的Tredshold Auto勾選掉，閾值數(shù)值調(diào)整范圍原則在指數(shù)增長(zhǎng)期。

閾值數(shù)值調(diào)整范圍原則在指數(shù)增長(zhǎng)期，該范圍中，曲線斜率相同，ΔCT值不變

 

•    注意同一板結(jié)果所有內(nèi)參目的基因閾值設(shè)定需一致，這樣的ΔCT有可比性。