免疫電鏡技術(shù)關(guān)鍵的幾個問題
免疫電鏡技術(shù)關(guān)鍵的幾個問題
免疫電鏡集電子顯微技術(shù)與免疫細胞化學技術(shù)于一體，能顯示抗原或抗體在細胞超微結(jié)構(gòu)水平的位置，已成為當今生物醫(yī)學領(lǐng)域的一項重要研究手段。由于免疫電鏡制作過程長，操作程序煩鎖，因此，要得到滿意的免疫金染色切片，必須在關(guān)鍵環(huán)節(jié)上給予注意，以下我們就免疫電鏡染色技術(shù)中的幾個問題進行探討。（相關(guān)實驗技術(shù)服務(wù)：免疫電鏡技術(shù)服務(wù)）
1、染色標本的固定
理想的免疫電鏡標本固定既要保存組織的抗原，又要具有良好的細胞超微結(jié)構(gòu)。對于多數(shù)抗原，按常規(guī)電鏡技術(shù)固定標本會使其抗原性部分或完全消失，因此，免疫電鏡常用一些特殊的固定液，如過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液(PLP)、4%多聚甲醛固定液、多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液( PG)（相關(guān)試劑：戊二醛 25%溶液）及苦味酸-多聚甲醛固定液。我們在實際工作中發(fā)現(xiàn)，用1%多聚甲醛加0.01% -0.05%的戊二醛最理想。此固定液不但配置簡單，而且效果滿意。當然，對于某些抗原性較強的標本，也可采用4%多聚甲醛加0.05%~0.5%的戊二醛固定。有的甚至可以直接采用常規(guī)電鏡固定液固定。
2、包埋劑的選擇
被檢組織采用包埋前或包埋后方法進行免疫染色，應視被標記抗原的情況而定。通常對僅檢測細胞表面的抗原選擇包埋前染色，這樣，不存在脫水、浸透及聚合對細胞抗原的破壞規(guī)包埋劑即可。相反，包埋后染色是在標本包埋后才進行免疫染色，對抗原常常造成較大的破壞，因此，應根據(jù)待檢抗原的性質(zhì)選擇合適的包埋劑．以減少對抗原的破壞，提高陽性檢出率。Epon812為最常用的電鏡包埋劑，它要求標本在包埋前必須徹底脫水，一般還需要在60℃聚合，因此，對抗原性往往有較大的破壞。我們在工作中采用低溫長時間聚合，45℃3天，日的減少聚合反應對抗原性保存的影響。為了減少對組織抗原性的破壞，以獲得很強的陽性染色結(jié)果，不少實驗室應用低溫包埋劑、透明合成樹脂及水溶性包埋劑（乙二醇甲酯）。通常在鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術(shù)的包埋后染色中，采用低溫包埋劑。
3、抗血清和探針
要獲得理想的免疫染色，選擇具有特異性高、親和力強的抗血清是實驗成功的首要條件。一般實驗所用的一抗都是通過市場購買（點擊查看：查找抗體），購置的一抗?jié)饪s液在使用前須用抗體稀釋液稀釋，本文認為包埋后免疫電鏡染色用的一抗?jié)舛纫哂诠忡R染色的使用濃度10~100倍。有時造成染色失敗的原因之一，就是因為把光鏡免疫組化染色的抗體作為一抗。
探針一般用于電鏡下觀察，通常使用膠體金顯示。膠體金探針既可以通過市場購買，也可以按Slot方法自己制備。一般制備的膠體金直徑為5nm，10nm，15nm幾種規(guī)格。
4、特異性吸附問題
免疫電鏡染色時，通常使用膠體金作為探針，然而膠體金是一種高度敏感的探針，如何克服背景，提高染色結(jié)果的特異性便成為膠體金免疫電鏡檢查的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。使用效價高、特異性強的一抗和活性穩(wěn)定、濃度適當?shù)拿庖呓鹛结樢约案哔|(zhì)量稀釋度合適的抗體是克服背景污染、獲得理想標記結(jié)果的重要條件。隨著稀釋度的增加，污染蛋白的影響會逐漸減弱。一般在檢測某種新的抗原時，須通過方陣滴定來確定一抗及金標抗體的稀釋度。另外，還可以使用高鹽及含去污劑的緩沖液進行洗脫，以減少背景污染，通常在緩沖液中加入氯化鈉及Triton X-100，使其濃度分別為2.5%及1%即可。當然一抗和金探針時問的合適，也很重要。一般時間一抗24 h(4℃)，金探針常溫2h。在實驗中，我們常用正常羊血清(1:50-1:100)或1%牛血清白蛋白作為封閉劑，以阻斷非特異性吸附。
