快速了解染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）

ChIP技術(shù)的原理

在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來，以富集存在組蛋白修飾或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA片段，再通過多種下游檢測技術(shù)（定量PCR、基因芯片、測序等）來檢測此富集片段的DNA序列。(檢測相關(guān)技術(shù)服務(wù)：Real-time PCR技術(shù)服務(wù)、基因芯片及結(jié)果驗(yàn)證服服務(wù)、高通量測序及結(jié)果驗(yàn)證服務(wù))

ChIP技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)包括3個(gè)獨(dú)立的步驟，即固定、沉淀和檢測。
第1步 固定
甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。首先在體內(nèi)用甲醛固定DNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物，需要注意甲醇的交聯(lián)時(shí)間，如果過長，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過程中丟失；交聯(lián)時(shí)間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。交聯(lián)反應(yīng)可加入甘氨酸終止。然后用化學(xué)（微球菌酶）或者機(jī)械（超聲波）的手段將其隨機(jī)切成一定長度的染色質(zhì)小片段（200～1000bp）。
第2步 免疫沉淀
利用目的蛋白質(zhì)或者目的蛋白質(zhì)上標(biāo)簽的特異性抗體，通過抗原和抗體反應(yīng)形成DNA－蛋白質(zhì)－抗體復(fù)合體，然后沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。
第3步 目的片段的純化與檢測
經(jīng)過熱處理及交聯(lián)，釋放共沉淀的DNA；再將DNA片段純化后，對沉淀的DNA樣品進(jìn)行檢測。目前檢測方法主要有3種：第1種是比較沉淀的模版與陰性和陽性對照PCR信號(hào)強(qiáng)度的普通PCR實(shí)驗(yàn)，或者相對精確的定量PCR方法。第2種是將沉淀的DNA與DNA微陣列芯片雜交（ChIP-on-ChIP），以檢測多基因軌跡全部的相互作用。第3種是高通量DNA測序分析。

ChIP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

與傳統(tǒng)的研究轉(zhuǎn)錄因子和DNA相互作用的方法相比，染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)是一種在體內(nèi)研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的理想方法。ChIP的優(yōu)點(diǎn)在于能夠在體內(nèi)捕獲轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的相互作用，能同時(shí)快速地提供一種或者多種基因的調(diào)控機(jī)制，因此有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

ChIP技術(shù)的局限性

第一，該技術(shù)需要抗目的蛋白或者特殊修飾標(biāo)簽的高度特異性抗體。
第二，假陰性信號(hào)可能源于無效的抗體結(jié)合或者在交聯(lián)過程中抗原受到干擾。
第三，甲醛固定可能是暫時(shí)的，甚至是非特異的，可能導(dǎo)致相鄰的蛋白形成假陽性信號(hào)。
第四，難以同時(shí)得到多個(gè)蛋白質(zhì)對同一序列結(jié)合的信息等。

針對前三方面，推薦在交聯(lián)之后和抗體沉淀之前繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定每次實(shí)驗(yàn)所需染色質(zhì)的最佳量，確保材料的起始量相等。當(dāng)檢測的染色質(zhì)模版（目的抗體的染色質(zhì)免疫沉淀物）擴(kuò)增出可檢測的條帶時(shí)，將染色質(zhì)樣品連續(xù)稀釋以確定關(guān)鍵點(diǎn)；而此時(shí)對照（mockChIPed）染色質(zhì)模版需要濃縮以擴(kuò)增出可見的條帶�？傊�，染色質(zhì)免疫共沉淀的步驟是需要精確的且要求一系列的預(yù)實(shí)驗(yàn)。

ChIP技術(shù)的應(yīng)用

ChIP方法能研究DNA甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同結(jié)合，或者從預(yù)測的靶基因中確定直接的靶位點(diǎn)。ChIP技術(shù)和其它分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合（例如普通PCR，實(shí)時(shí)定量PCR，基因克隆，DNA微陣列或者更直接的高通量測序技術(shù)），已經(jīng)被用于確定轉(zhuǎn)錄因子和DNA的相互作用或轉(zhuǎn)錄因子新的基因組靶位點(diǎn)。

最初，ChIP應(yīng)用于哺乳動(dòng)物、酵母、果蠅染色質(zhì)的研究上；后來，被應(yīng)用在相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和修飾后組蛋白位置等方面的研究方面。ChIP技術(shù)還能用于研究蛋白和蛋白之間的相互作用，如通過酵母雙雜交和ChIP證實(shí)了DELLA蛋白與PIF3蛋白之間的相互作用。

隨著ChIP技術(shù)的進(jìn)一步完善，它必將會(huì)在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。而由于ChIP實(shí)驗(yàn)涉及的步驟多，結(jié)果的重復(fù)性較低，因此研究人員對ChIP實(shí)驗(yàn)過程的每一步都應(yīng)設(shè)計(jì)相應(yīng)的對照，而且對結(jié)果的分析也需要有一定的經(jīng)驗(yàn)。對剛剛開始使用ChIP技術(shù)的實(shí)驗(yàn)新手，選用成熟的商品化試劑盒和相關(guān)的技術(shù)服務(wù)可達(dá)到事半功倍的效果。（相關(guān)試劑盒：Pierce Agarose ChIP Kit，相關(guān)技術(shù)服務(wù)：染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）技術(shù)服務(wù)）