新型均相Fura-2鈣流檢測實驗介紹
Fura-2 QBT試劑盒——新型鈞相Fura-2鈣流檢測實驗
Fura-2 染料一直以來被認為是在細胞成像、GPCR 介導的細胞內(nèi)鈣流、以及離子通道激活等實驗中檢測鈣動員的重要工具。這種比值法檢測染料通過計算結(jié)合和未結(jié)合兩種狀態(tài)之間的熒光強度比值，有助于糾正由于染料添加或細胞鋪板造成的誤差。然而，傳統(tǒng)的Fura-2 染料必須要進行緩沖液清洗，從而對于每一個實驗來說都提高孔間差異性并需要耗費更多時間且增加操作復雜性。
Molecular Devices®推出的Fura-2 QBT™鈣流試劑盒是基于專利的信號湮滅技術(shù)，含有比值法檢測的Fura-2 鈣離子指示劑，提供均相實驗體系并減小細胞基礎的差異性, 從而通過在檢測前去除細胞清洗步驟間接增加通量。另外, Fura-2 QBT.鈣流試劑盒是在紫外光譜處激發(fā)，最大程度使得研究者可以減少488nm激發(fā)的化合物熒光信號的干擾。
特點：
基于信號湮滅技術(shù)，獲得更大信號窗口
免洗和比值法信號檢測使得實驗差異性降至最低
免洗步驟節(jié)省了時間和實驗成本
實驗原理
Fura-2 AM 是一種鈣離子敏感染料，在340 nm 和380 nm 被激發(fā)，發(fā)射波長是510 nm。染料結(jié)合了鈣離子后其吸收波長從380nm 轉(zhuǎn)移到340nm。圖1 顯示了鈣離子結(jié)合Fura-2 后340/510nm 發(fā)射的信號（綠）的增加，而380/510 nm 發(fā)射的信號（橙）下降。計算兩種發(fā)射的信號比值（插圖）來檢測用于擬合量效曲線的最大值減去最小值后的信號效應。
Fura-2 QBT.鈣流實驗準備
本次實驗中使用的是小規(guī)格的Fura-2 QBT.鈣流試劑盒（PN #R8197）。染料重懸在含有20 mM
HEPES 的 Hank’s 平衡鹽溶液（HBSS）。 丙磺舒（PBX）在需要時加入，用以抑制染料被轉(zhuǎn)移出細胞內(nèi)。貼別的CHO M1 細胞或HeLa 細胞實驗前過夜種在黑壁底透的384 孔板中，在試驗時從培養(yǎng)箱中取出。含有Fura-2 QBT 染料或者其它染料的25μL 緩沖液加入到每個孔中，同時孔中需含有25μL 緩沖液或培養(yǎng)基。加載了Fura-2 QBT.鈣流試劑（PN #R8197）或BD 比值法鈣流試劑（#644243）的細胞記錄板在37°C、5%CO2 孵育一小時。為便于對比，采用了傳統(tǒng)的Fura-2 清洗方法。
按照此傳統(tǒng)的Fura-2 清洗方法，在加入50μL 的1X 染料緩沖液之前去除每個孔中的培養(yǎng)基，然后去其它試劑盒一樣細胞記錄版在同樣的條件和時間下進行孵育。在FlexStation®3 微孔讀板機或FLIPR® Tetra 系統(tǒng)上開始記錄前，所有記錄板從培養(yǎng)箱中取出并降溫至室溫10 分鐘。采用了傳統(tǒng)Fura-2 清洗方法的記錄板需要在開始記錄前用HBSS 實驗緩沖液清洗3 次以去除多余的染料。
FlexStation 3 和FLIPR Tetra 系統(tǒng)上的比值法鈣流檢測實驗在384 孔的聚丙烯化合物板中將5 倍濃度的相應配體溶于含20mMHEPES 的HBSS 緩沖液中。在FlexStation3（圖2）或FLIPRTetra系統(tǒng)（圖3）檢測過程中加入激動劑，儀器參數(shù)進行了優(yōu)化以適應于比值法檢測實驗。染料的激發(fā)波長是340nm和380nm。在510 nm 檢測到發(fā)射信號，每個孔中兩個激發(fā)波長下的相對熒光單位（RFU）的記錄持續(xù)大約90 秒，包括加樣前和加樣后。實驗中每個采樣時間點的計算后的輸出結(jié)果是340nm 與380nm 波長信號的比值。最大值減去最小值的計算來源自比值信號曲線。量效曲線和EC50/IC50 濃度統(tǒng)計計算所需的數(shù)據(jù)從ScreenWorks®或SoftMax® Pro軟件中輸出， 然后用GraphPad Prism 進一步擬合和計算。 根據(jù)Zhang, et. al 發(fā)表的方法進行.Z值的計算。
結(jié)果
結(jié)論
相對于傳統(tǒng)Fura-2 實驗，Fura-2 QBT.鈣流試劑盒提供了均相的實驗體系，通過使用Molecular Devices 公司基于信號湮滅的專利技術(shù)無需再對細胞進行沖洗。因此將提高通量、減小細胞鋪板或沖洗時細胞丟失等造成的實驗差異性，并節(jié)省了實驗成本（因為差異性而需要重復實驗帶來的緩沖液和耗材）。相比于BD 比值法鈣流試劑盒（#644243）傳統(tǒng)的Fura-2 細胞沖洗實驗，Fura-2 QBT.鈣流試劑盒可得到最大的信號窗口以及在EC80 或IC80 下最好的Z 值。因為Fura-2 燃料在紫外范圍激發(fā)，從而避免了化合物488nm 激發(fā)的自發(fā)熒光的干擾。Fura-2 QBT.鈣流試劑盒在FLIPRTetra 系統(tǒng)和FlexStation 3 微孔板檢測平臺上進行了充分的驗證，提供了可重復、可量化操作的解決方案，適合于高通量的篩選工作。
