通過篩選抑菌圈發(fā)現(xiàn)新型抗生素實驗介紹

 

為了滿足針對耐藥性微生物治療不斷增長的需求，開發(fā)出了基于競爭的自適應(yīng)進化篩選方法。這種方法存在的一個難題就是如何從一個多樣性的微生物克隆庫中找到高價值的菌株，篩選到適合下游藥物開發(fā)，能夠產(chǎn)生新型抗生素的最好候選菌株。

 

對于從克隆庫中篩選抗生素產(chǎn)生菌株來說，通常使用瓊脂平板抑菌圈或透明圈篩選法。具有抗性的克隆可以產(chǎn)生并分泌對平板微生物具有抑制作用的代謝產(chǎn)物，因此在克隆周圍產(chǎn)生了透明圈，根據(jù)透明圈的大小可以準(zhǔn)確地從克隆庫中篩選出這些菌株。透明圈的直徑和抗性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量一般成正比例關(guān)系。因此，高價值的菌株通常產(chǎn)生直徑最大的透明圈。這些克隆被篩選出來用于進一步的特性研究和藥物開發(fā)。

 

如果使用人工篩選并挑取產(chǎn)生抑菌圈的克隆，整個過程不但慢、煩瑣，而且易出錯。為了解決這些問題，Molecular Devices開發(fā)出了QPix400系列微生物克隆篩選系統(tǒng)，提供了高通量自動化克隆篩選和挑取平臺，具有無與倫比的性能和效率。這里我們詳細描述了如何使用這個系統(tǒng)以及軟件模塊客觀篩選并挑取高價值的透明圈產(chǎn)生菌株。

 

·適用于各種適應(yīng)性進化方面的應(yīng)用

·加快新型耐藥菌株感染治療方法的開發(fā)速度

·用戶自定義軟件參數(shù)，發(fā)現(xiàn)獨特的生物學(xué)特性

·通過可靠的自動化解決方案篩選高價值克隆

 

Streptomyces clavuligerus可以產(chǎn)生超過20種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物。包括許多B-內(nèi)酰胺類抗生素，如cephamycin C、cephalosporin C、clavulanic acid等。這里使用Streptomyces clavuligerus(ATCC 27064)作為模式生物，演示針對E.coli (Migula, Castellani and Chalmers ATCC 47076)的抑菌圈的識別和挑取。兩個菌株都從ATCC獲得，使用TSB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。液體培養(yǎng)階段使用搖床培養(yǎng)1-3天，相應(yīng)的S. clavuligerus在30℃，E.coli在37℃培養(yǎng)。S. clavuligerus經(jīng)過培養(yǎng)后，稀釋培養(yǎng)液OD600值在0.10-0.13之間，取2ul培養(yǎng)液點到TSA瓊脂板上，28℃培養(yǎng)3-5天。S.clavuligerus在TSA平板生長后，經(jīng)過稀釋的E.coli培養(yǎng)液被均勻地涂布到平板上，確保E.coli完全環(huán)繞并接觸到每個S.clavuligerus克隆。平板28℃繼續(xù)培養(yǎng)1 - 2 天， 并每天觀察。如圖1 所示，S.clavuligerus克隆產(chǎn)生針對E.coli的抑菌圈。

 

 

使用QPix400系統(tǒng)的抑菌圈識別軟件模塊對平板進行白光成像，如圖2所示，軟件識別具有透明圈的克隆。高級的軟件算法應(yīng)許用戶自定義篩選參數(shù)，篩選并挑取符合特定要求的抑菌圈，如克隆大小、抑菌圈直徑、克隆直徑、軸比以及克隆邊緣形狀等（圖2）。

 

 

接下來，軟件選擇的可以產(chǎn)生抑菌圈的克隆以縮略圖的形式排列�？寺】梢砸远喾N順序進行排列，比如總的透明區(qū)域大小、克隆大小、軸比、邊緣形狀等（圖3）。軟件自動列出了每個產(chǎn)生抑菌圈克隆的詳細定量數(shù)據(jù)，方便隨時查看。

 

 

 

為了進一步驗證基于克隆庫或者自適應(yīng)進化的自動抑菌圈識別和篩選方法的效果，篩選了點有多樣微生物克隆庫的QTrays培養(yǎng)板。專用的軟件模塊從QTray上長出的48個克隆中準(zhǔn)確篩選出了3個產(chǎn)生抑菌圈的克隆(如圖4)。這種方法可以實現(xiàn)高通量有目的性地從一個大的微生物克隆庫中篩選、識別和挑取產(chǎn)生透明圈的克隆。

 

 

市場需要不斷開發(fā)出新型抗生素用于治療耐藥菌感染引起的疾病。為了開發(fā)新型抗生素或者微調(diào)抗生素的生物合成途徑，國內(nèi)外科研人員付出了許多的努力�；�于克隆庫篩選或者基于競爭性自適應(yīng)進化都可以用于產(chǎn)生廣譜抗生素過量產(chǎn)生菌株。

 

使用QPix400系列微生物克隆篩選系統(tǒng)以及QPix抑菌圈軟件識別模塊，我們可以輕松并且可靠地進行高通量篩選透明圈產(chǎn)生克隆。這個自動化的篩選方法將大大增加我們尋找新型抗生素的能力，用于應(yīng)對已有的或者新出現(xiàn)的抗生素耐藥菌引起的疾病。