應(yīng)用FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒對hERG通道阻斷劑特性的分析

 

藥物誘導(dǎo)的hERG (human ether-a go-go-related gene) 離子通道被阻斷可能導(dǎo)致嚴(yán)重的致死性室性心律失�！�—尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速（torsade de pointes, TdP）。近年來，一批FDA 已批準(zhǔn)藥物由于其對hERG 的脫靶效應(yīng)而被迫從市場上撤出。由此，愈發(fā)凸顯了在藥物研發(fā)早期階段開展候選藥物hERG 安全性篩選的重要性和快速增長的需求。本文重點(diǎn)闡述了一種新型鉀離子通道檢測試劑盒在FLIPRTETRA 高通量實(shí)時(shí)熒光成像分析系統(tǒng)上對hERG 陽性化合物的效應(yīng)進(jìn)行了評估和檢測。實(shí)驗(yàn)根據(jù)鉀離子(K+)通道對鉈離子(Tl+)的通透性，采用了對鉈離子敏感的熒光染料作為指示劑。實(shí)驗(yàn)對幾種常見的hERG 陽性抑制劑的藥理效應(yīng)進(jìn)行了檢測，結(jié)果與IonWorks Barracuda® Plus 全自動膜片鉗系統(tǒng)得到的數(shù)值作比較。

 

FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒（圖1）含有鉈離子敏感的指示染料。在開始染料加載步驟中，含有乙酰氧基甲（AM）酯的鉈離子指示染料通過被動擴(kuò)散方式穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。細(xì)胞質(zhì)酯酶剪切掉乙酰氧基甲（AM）酯并釋放出其激活的熒光形態(tài)。另外，在細(xì)胞外采用了專利的屏蔽染料技術(shù)從而降低了背景熒光信號的干擾。可通過向細(xì)胞溶液中加入混合的K⁺和Tl⁺或包含了Tl⁺的配體來激活鉀離子通道。熒光信號的增強(qiáng)表明了鉈離子特異性地通過鉀通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而對鉀通道活性進(jìn)行了功能性檢測。

 

 

FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒(Molecular Devices cat. #R8222) 含有Tl⁺敏感染料、屏蔽染料、200 mM K₂SO₄、50 mM Tl₂SO₄、5X 不含氯離子的緩沖液以及HBSS + 20 mM HEPES 緩沖溶液。每個(gè)包裝的試劑盒可以完成10 塊96，384，或1536 孔板。實(shí)驗(yàn)檢測流程見圖2。

 

 

 

疏水性化合物由于非特異性結(jié)合到化合物板等實(shí)驗(yàn)耗材中，會影響到其顯著的效能值。在本實(shí)驗(yàn)中，化合物首先在100%DMSO 中被稀釋，然后在實(shí)驗(yàn)前立即轉(zhuǎn)移到含HBSS+ 20 mM HEPES 緩沖溶液的玻璃襯里的多孔板中。

 

細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人Kv11.1（hERG）離子通道的中國倉鼠卵巢（CHO）由ChanTest 公司（Cleveland, OH）提供。實(shí)驗(yàn)開始2 天前在黑壁底透的384 孔板中按照每孔6500 個(gè)細(xì)胞的密度種植細(xì)胞，培養(yǎng)基中包含了篩選抗生素并在37℃和 5% CO₂ 條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前24 小時(shí)生長培養(yǎng)基更換為含四環(huán)素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)前4 小時(shí)細(xì)胞從37℃轉(zhuǎn)移至 28℃條件下培養(yǎng)以增加hERG 通道的表達(dá)。然后細(xì)胞板加入染料在室溫下避光孵育一小時(shí)。

 

為進(jìn)行藥理學(xué)特性分析，先加入hERG通道阻斷劑并在室溫下孵育30 分鐘。FLIPR^Tetra 系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)檢測過程中向每個(gè)孔中加入之前優(yōu)化好的緩沖液。系統(tǒng)采用了470-495nm 的LED 激發(fā)光源和515-575nm 的發(fā)射濾片。為進(jìn)行對比，使用FluxOR 試劑盒（Life Technologies）進(jìn)行了平行實(shí)驗(yàn)。依照生產(chǎn)廠家提供的方案進(jìn)行操作。數(shù)據(jù)采樣間隔為1 秒并持續(xù)140 秒。結(jié)果導(dǎo)出到GraphPad Prism 軟件進(jìn)行分析。

 

實(shí)驗(yàn)方案開發(fā)中首先取決于刺激hERG通道所需鉈離子和鉀離子濃度的優(yōu)化。多孔板中放置多種濃度的K₂SO₄ 和Tl₂SO₄ 緩沖液。Tl⁺ 和 K⁺緩沖液用1倍濃度的不含氯離子的緩沖溶液稀釋。由于每摩爾硫酸鉈和硫酸鉀含有2 份的陽離子，因而被看作為兩倍的濃度進(jìn)行處理。FLIPR^Tetra 系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)檢測過程中向每個(gè)孔中加入刺激緩沖液。不同濃度誘發(fā)的信號曲線進(jìn)行比較以確定最大信號對應(yīng)的最優(yōu)濃度值。結(jié)果顯示，產(chǎn)生最大hERG 信號的最優(yōu)Tl⁺ 和 K⁺濃度分別是1mM 和10mM（圖3）。

 

 

 

為便于結(jié)果比較，所有同樣的hERG 通道阻斷劑均在IonWorks Barracuda1 全自動膜片鉗系統(tǒng)進(jìn)行了檢測得到相應(yīng)的IC₅₀ 值（圖4）。為觀察化合物的頻率依賴性效應(yīng)，電壓刺激命令均以0.1Hz 頻率在加樣前后分別刺激5 次。第五個(gè)電流信號記錄的sweep 中hERG 尾電流峰值被用來測定化合物效應(yīng)。

 

 

 

應(yīng)用FLIPR鉀通道檢測試劑盒對七個(gè)已知的hERG 阻斷劑的效應(yīng)進(jìn)行評估。量效反應(yīng)曲線見圖5。IC₅₀ 值與IonWorks Barracuda 全自動膜片鉗系統(tǒng)檢測的IC₅₀的比較見表1 兩者具有很好的相關(guān)性。

 

 

另外，其中3 個(gè)化合物被用于評估比較另一種基于鉈離子的試劑盒——FluxOR 鉀離子通道試劑盒（圖6）。兩者所得到的IC₅₀ 值很接近，具體見表2。然而，F(xiàn)LIPR 鉀離子通道檢測試劑盒的信號窗口是的2.25（基于信號與基線的比例），這一數(shù)值顯著高于FluxOR（信號窗口是0.5）。表明了FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確、更可靠。陰性對照是4μM 特非那定對hERG通道的阻斷效應(yīng)，陽性對照是刺激性緩沖液對hERG 通道的效應(yīng)。更低的空間差異和更大的信號窗口產(chǎn)生了更大的Z因子值，見圖7。這可能源于FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒是真正的均相實(shí)驗(yàn)體系且是免洗的或無需更換培養(yǎng)基，從而顯著減小了孔間差異性。

 

 

 

 

 

FLIPR鉀離子通道檢測試劑盒 采用均相 免洗 的實(shí)驗(yàn)方案檢測鉀離子通道功能活性。 在本文中，我們應(yīng)用 了 hERG通道陽性抑制劑驗(yàn)證了 FLIPR鉀離子通道檢測試劑盒和電生理方法得到的結(jié)果是高度相關(guān)。

 

在另個(gè)單獨(dú)運(yùn)行的實(shí)驗(yàn)中， 相比于其它同類型試劑盒來說， FLIPR鉀離子通道檢測試劑盒 表現(xiàn)出了顯著性更高的 信號窗口以及Z因子值。 明顯提升的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表現(xiàn) ，結(jié)合 FLIPR^Tetra系統(tǒng)的高通量性能，在 藥物研發(fā)早期階段將為究者提供一種強(qiáng)大的 hERG風(fēng)險(xiǎn)評估分析平臺。