應(yīng)用ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯估計蛋白質(zhì)的分子量

 

·簡單的一套的標準品就可以滿足凝膠可視、膜定位和時間分辨熒光檢測 

·蛋白質(zhì)都已經(jīng)被生物素標記 

·可以檢測待測物的分子量 

·無需混勻和加熱

 

ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯是ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)必不可少的一項組成。蛋白質(zhì)梯最初始是應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子定量，凝膠電泳的可視化，已經(jīng)評估轉(zhuǎn)膜的過程。

 

ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯由7個生物素標記的重組蛋白，以及3個預(yù)染的蛋白質(zhì)marker組成。實驗通過在二抗階段加入銪標記的鏈霉親和素，從而實現(xiàn)生物素標記蛋白的檢測。標記好的膜可以通過安裝在SpectraMax I3或SpectraMax Paradigm多功能酶標儀上的ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測卡盒進行讀取。

 

ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯： ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯包含7個生物素標記的重組蛋白，分子量分別為10、20、40、50、80、100和140KD。它們的檢測是通過將膜與銪標記的鏈霉親和素一起孵育，并在ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)上以亮顏色條帶顯示（圖表1，左邊）。另外，這里還包括三個可見的預(yù)染好的marker，分別是18、31和70KD（圖表1，右邊）。這些藍色的條帶在電泳的膠條上、在轉(zhuǎn)膜后都清晰可見。它們在ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)上也會呈現(xiàn)暗色的條帶。我們通過圖表2上所示的實驗比較了一組參照標準曲線，以此來確定生物素標記階梯蛋白的分子量與它們在膠條上的遷移距離的線性關(guān)系。

 

 

 

圖1: ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯。白色的條帶表示用于檢測膜上蛋白分子量的生物素標記的蛋白。在和銪標記的鏈霉親和素孵育后，便可用ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)進行讀取。暗色的條帶是預(yù)染蛋白，用以監(jiān)測蛋白質(zhì)電泳、雜交定位和轉(zhuǎn)膜效率。在這些過程中，這些藍色的條帶都是肉眼可見的。

圖2：遷移vs分子量。將7個蛋白在ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯上的遷移距離繪制及擬合為各自的分子量的函數(shù)。其線性關(guān)系與購置于Sigma公司的參照蛋白（貨號.#B2787）結(jié)果相類似。

 

ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測的流程在進行二抗孵育以前，都參照標準的跑膠和轉(zhuǎn)膜方法。然后隨著目標蛋白樣本，在膠條的一列加入4ul  ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯。不需要額外的加熱或其他準備步驟。在與一抗孵育后，進行封閉和洗膜，然后都以1:5000孵育銪標記的鏈霉親和素和銪標記的二抗。銪標記的鏈霉親和素結(jié)合在蛋白階梯上，然后銪標記的二抗特異性的結(jié)合在連接目的蛋白的一抗上。標記好的膜可以通過安裝在SpectraMax I3或SpectraMax Paradigm多功能酶標儀上的ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測卡盒進行讀取，這種卡盒是利用了時間分辨熒光技術(shù)（TRF）檢測銪元素。時間分辨熒光檢測可以顯著降低自發(fā)熒光、或者其他半衰期較短的發(fā)射光的背景噪音。同時也有效避免了化學發(fā)光和傳統(tǒng)熒光檢測中常出現(xiàn)的過曝情況；因此這個體系可以提供高信噪比的尖銳條帶。由于這個方法不涉及酶反應(yīng)，消除了蛋白定量中的固有變異性。另外，因為銪元素有抗光漂白作用，所以膜上的信號可以保持數(shù)周到一個月，并可以反復進行讀取。ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)，包括ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯，作為一種簡單、靈敏和穩(wěn)定的檢測平臺，給多功能酶標儀提供了出色的蛋白質(zhì)分析能力。

 

以下兩種分別檢測白介素-17和熱休克蛋白的實驗，都為ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯如何進行蛋白質(zhì)分子量評估提供了很好的依據(jù)。

 

將白介素-17（IL-17）上樣在4-20%梯度凝膠的1X緩沖液中跑30分鐘。將ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯也放于相同的膠上。蛋白質(zhì)將會轉(zhuǎn)移到熒光膜上，并與抗大鼠的IL-17過夜孵育，然后孵育1:5000的ScanLater銪標記抗大鼠IgG和1:5000的ScanLater銪標記抗鏈霉親和素抗體。如圖3a所示，當膜被清洗、晾干后，就可以通過安裝在SpectraMax I3多功能酶標儀上的ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測卡盒進行讀取了。通過ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯確定IL-17的分子量為14KD，與實際發(fā)表的分子量15KD近似。

 

熱休克蛋白(HSP70)是當細胞暴露在高于正常孵育溫度下誘導產(chǎn)生的。在這項研究中，我們將CHO-K1細胞和Hela細胞暴露在45攝氏度45-90分鐘，然后等6個小時后收集細胞提取物。最后將5ul提取物上樣在4-20%梯度凝膠中進行電泳,4ulScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯也放于相同的膠上。轉(zhuǎn)膜后，對膜進行封閉、清洗，并與抗小鼠的HSP70過夜孵育，然后孵育銪標記抗小鼠IgG1小時。在這個實驗中,蛋白階梯與抗銪標記抗鏈霉親和素分開孵育。如圖3 b中的反向圖所示,預(yù)染的標準品顯示灰白色條帶,因為染色淬滅了時間分辨熒光信號。兩個細胞系顯示HSP70隨著溫度的增加而增加。根據(jù)ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯估計，相比之下表明蛋白HSP70分子量大約是70 KD。

 

 

ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯可以實現(xiàn)用亮條帶評估分子大�。▓D表1），同時可以為凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和轉(zhuǎn)膜后提供可見的指標。這個系統(tǒng)允許用戶使用為了他們的應(yīng)用而優(yōu)化過的電泳和免疫印跡流程。孵育時建議使用銪標記抗鏈霉親和素和銪標記的二抗的蛋白酶抑制劑，這樣當使用SpectraMax I3多功能酶標儀進行讀取時，可以有效降低蛋白階梯和目的條帶的時間分辨熒光檢測背景。圖像都利用SoftMax Pro軟件進行采集，并且軟件可以集成導出到一個自定義的Excel中進行定量分析。隨著ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)梯的引入，ScanLater免疫印跡蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)為多功能酶標儀提供了更加出色的靈敏度和蛋白質(zhì)分析能力。