冷凍飲品中大腸埃希氏菌O157的檢測(cè)

   

夏天到了，全國(guó)各地又進(jìn)入了“燒烤模式”。4 月 23 日，廣州入夏；5 月 14 日，北京入夏；5 月 29 日，上海入夏。下圖為中國(guó)氣象網(wǎng) 8 月 3 日發(fā)布的一張高溫區(qū)域圖，紅色代表的高溫區(qū)域占據(jù)相當(dāng)大的比例。

在炎炎夏日中，美味而且清涼的冷飲，可以讓大家忘卻酷暑炎熱。市場(chǎng)上各種品牌的冰淇淋、冰棒、汽水、果汁等產(chǎn)品琳瑯滿目，極大地豐富了人民的物質(zhì)生活。但是冷飲的保存需要注意，通常都需要 4℃ 冷藏保存，部分冰品還需要 -20℃ 低溫保存。這些冷飲一旦融化后再?gòu)?fù)凍，里面就有可能會(huì)有細(xì)菌繁殖。

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 2759.1-2003 冷凍飲品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)微生物含量做出了具體要求，下表為具體信息：

項(xiàng)目	菌落總數(shù) （cfu/mL）	大腸菌群 （MPN/100mL）	致病菌
含乳蛋白冷凍飲品	≤ 25000	≤ 450	不得檢出
含豆類冷凍飲品	≤ 20000	≤ 450	不得檢出
含淀粉或果類冷凍飲品	≤ 3000	≤ 100	不得檢出
食用冰塊	≤ 100	≤ 6	不得檢出

大腸埃希氏菌（E. coli）通常被稱為大腸桿菌，這些細(xì)菌常寄居在人和動(dòng)物的消化道，并隨糞便排出體外，廣泛分布在水和土壤中。大多數(shù)腸道桿菌屬于正常菌群，當(dāng)機(jī)體免疫力降低或侵入腸道外組織時(shí)，成為條件致病菌而引起疾病。腸出血性大腸桿菌（EHEC）是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以 O157:H7 血清型為代表菌株。根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，大腸埃希氏菌 O157 在冷凍飲品中不得檢出。

根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，RephiLe 特別推薦下面的冷凍飲品中大腸埃希氏菌 O157 檢測(cè)解決方案。檢測(cè)方案按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)在固體培養(yǎng)基表面分離得到的典型菌落，該菌落能產(chǎn)品吲哚反應(yīng)以及使 O157 血清產(chǎn)生凝集：

一、儀器

干熱滅菌箱和濕熱滅菌器；培養(yǎng)箱；PH 計(jì)；無(wú)菌接種環(huán)；移液器；磁性架；旋轉(zhuǎn)混合器；Direct-Pure UP 超純水系統(tǒng)。

二、試劑

增菌液：mTSB + N（改良胰蛋白胨大豆肉湯 mTSB + 新生霉素溶液）；CT-SMAC培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)瓊脂；胰蛋白胨培養(yǎng)基；吲哚反應(yīng)培養(yǎng)基；抗大腸埃希氏菌 O157 免疫磁珠；改良蛋白胨緩沖液，0.01 mol/L，PH 7.2；生理鹽水；Kovac's 靛基質(zhì)試劑；大腸埃希氏菌 O157 抗血清。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1、取樣

取 (x) g 或是 (x) mL 樣品加入 9(x) g 或是 9(x) mL mTSB + N 增菌液中，于41.5℃培養(yǎng)，最后的樣品與 mTSB + N 體積比為 1:10。

2、增菌

將上述增菌液于 41.5℃ 培養(yǎng) 6 h，隨后再培養(yǎng) 12 - 18 h，總計(jì)培養(yǎng) 18 - 24 h。6 h 培養(yǎng)后進(jìn)行隨后的免疫技術(shù)分離以及選擇性培養(yǎng)基上接種得到的假陽(yáng)性結(jié)果在 18 h 培養(yǎng)后可能得到的是陰性結(jié)果。

3、免疫磁珠分離(IMS)

混合增菌液，將食物的殘?jiān)鼦壢ァ?/p>

取一個(gè)離心管，加入 20 μL 已準(zhǔn)備好的平衡到室溫的免疫磁珠微粒。取 1 mL 增菌液的上清液，避免吸入實(shí)物雜質(zhì)或是脂肪加入到離心管中。在旋轉(zhuǎn)混合器上以 12 - 20 r/min 的速率將混懸液混合 10 min。

把離心管放置在磁性架上，將磁珠聚集起來(lái)，確保避免磁珠微粒吸附在管壁上。打開(kāi)管蓋（離心管保持在磁性架上），使用無(wú)菌巴斯德吸管把液體從管子的底部慢慢吸起來(lái)，每個(gè)樣品均使用一個(gè)新的吸管。加入 1 mL 無(wú)菌緩沖清洗液蓋上管蓋，將離心管從磁性架上取下，正反顛倒混勻后放回磁性架。

重復(fù)上述清洗過(guò)程數(shù)次。

最后加入 100 μL 無(wú)菌緩沖清洗液使磁珠重新懸浮，然后從磁性架上取下。

4、接種

吸取 50 μL 懸浮液接種到預(yù)先干燥的 CT-SMAC 上，使用無(wú)菌接種環(huán)劃線以得到分離良好的單菌落。

37℃ 培養(yǎng) 18 - 24 h。

在 CT-SMAC 平板上，典型菌落形態(tài)為透明或是接近無(wú)色，菌落周?chē)�出現(xiàn)黃棕色，菌落直徑為 1 mm。

5、確診

5.1 選擇菌落

每塊平板上選擇 5 個(gè)典型菌落，如果典型菌落少于 5 個(gè)則全部選擇。將典型菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上分離純化。37℃ 培養(yǎng) 18 - 24 h。需選用純菌落進(jìn)行鑒定。

5.2 生化鑒定：吲哚反應(yīng)

挑取一個(gè)純化的單菌落于胰蛋白胨培養(yǎng)基中。37℃ 培養(yǎng) 24 h。加入 1 mL Kovac's 靛基質(zhì)試劑，室溫下放置 10 min。出現(xiàn)紅色環(huán)為陽(yáng)性反應(yīng)，出現(xiàn)黃色環(huán)為陰性反應(yīng)。

5.3 血清確診

只有吲哚反應(yīng)陽(yáng)性的菌落需要進(jìn)行大腸埃希氏菌 O157 血清反應(yīng)。

滴一滴生理鹽水在一塊干凈的玻片上，用接種環(huán)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上挑取一個(gè)菌落于生理鹽水上，使菌落在生理鹽水里均勻分散，晃動(dòng)玻片 30 - 60 s，在黑色背景下進(jìn)行觀察。如果菌懸液形成塊狀，則該菌株是自動(dòng)凝集菌株，不能進(jìn)行特定抗血清的測(cè)試。

挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的純菌落在玻片上，懸浮于生理鹽水中，滴加一滴大腸埃希氏菌 O157 抗血清。如果在 1 min 內(nèi)出現(xiàn)凝集，則該反應(yīng)為陽(yáng)性。

菌落為吲哚陽(yáng)性，并滿足 O157 抗血清或是 O157：H7 抗血清陽(yáng)性。菌落即可鑒定為大腸埃希氏菌 O157。

6、質(zhì)量控制

6.1 質(zhì)量控制菌株

從國(guó)家菌種保藏中心可以得到不具毒性的大腸埃希氏菌 O157 菌株，該菌株可以用于培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量控制。

6.2 培養(yǎng)方法

為了測(cè)試實(shí)驗(yàn)室能力以及按照該國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)描述的測(cè)試方法測(cè)試培養(yǎng)基對(duì)于低含量的大腸埃希氏菌 O157 的檢出能力，準(zhǔn)備一個(gè)低濃度不含致病性的大腸埃希氏菌 O157 參考樣品和一個(gè)添加大量其他大腸埃希氏菌的樣品進(jìn)行平行測(cè)試。

7、檢出限與報(bào)告限

按照結(jié)果解釋，在指定的質(zhì)量或是體積樣品中，根據(jù)本方法檢出或是未檢出大腸埃希氏菌 O157。

在包括大腸埃希氏菌 O157 在內(nèi)的致病菌檢測(cè)及菌落總數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基配制、試劑配制等步驟需要用到純水。RephiLe 特別推薦 Direct-Pure UP 一體化超純水系統(tǒng)。Direct-Pure UP 是一款以自來(lái)水為進(jìn)水，同時(shí)生產(chǎn) RO 純水和超純水的超純水系統(tǒng)。Direct-Pure UP 生產(chǎn)的超純水經(jīng)雙波長(zhǎng)紫外燈殺菌并分解有機(jī)物、0.22 μm 終端濾器截留后，超純水中細(xì)菌含量小于 1 cfu/mL，可以用來(lái)配制培養(yǎng)基和試劑溶液；RO 純水可以用來(lái)清洗實(shí)驗(yàn)器皿及水浴。Direct-Pure UP 可以選配取水手柄，內(nèi)置電阻率檢測(cè)儀，可以實(shí)時(shí)反映取水點(diǎn)的真實(shí)水質(zhì)；手柄連線長(zhǎng)達(dá) 3 米，遠(yuǎn)程取水輕松自由，方便舒適。RephiLe 還可以提供純水系統(tǒng)的驗(yàn)證服務(wù)，幫助用戶完成符合 ISO、GMP、GLP 的系統(tǒng)驗(yàn)證，滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)于相關(guān)認(rèn)證活動(dòng)的要求。確保您在使用中安心，放心，用水無(wú)憂。             

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