MD使用CloneSelect Imager系統(tǒng)在半固體培養(yǎng)基中進行單克隆驗證
簡介
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優(yōu)勢 · 快速成像，高效鑒定單克隆細胞系 · 準確追蹤單個細胞的生長 · 可以在半固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中對細胞成像，實驗方案靈活選擇
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生物藥品審批的監(jiān)管標準一直都在不斷變化。其中用于細胞系單克隆來源的監(jiān)管條例驅(qū)使我們要在生物藥物開發(fā)過程中使用更有效的技術(shù)或方法。許多研究人員通常使用成像系統(tǒng)（如CloneSelect Imager）在液體培養(yǎng)基中驗證單克隆和監(jiān)控細胞的生長。其實，CloneSelect Imager系統(tǒng)也可以在半固體培養(yǎng)基中對細胞進行成像。細胞在半固體培養(yǎng)基中的位置比較固定，使研究人員可以更加準確地在不同時間點對同一個細胞進行成像。
實驗室常規(guī)方法通常使用有限稀釋進行細胞克隆。但是，這種方法使用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，使追蹤細胞變得比較困難或不夠準確。因為在處理微孔板的過程中，懸浮細胞容易在孔內(nèi)發(fā)生位置移動（Figure 1）。不能確保不同時間點成像的 是同一個細胞，從而大大降低單克隆驗證的準確性。此外，有限稀釋有可能在一個孔內(nèi)加入多個細胞，需要進行額外多次亞克隆來提高單克隆的概率。
使用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞給科研人員提供了一個更快更簡單的克隆方法，而且有利于追蹤細胞的生長。細胞在半固體培養(yǎng)基中的位置相對固定，在常規(guī)實驗操作過程中細胞位置不會移動，可以生長成獨立單個的細胞克隆。所以，可以在同一個孔內(nèi)種植多個細胞，而且通過不同時間點成像，能夠清晰追蹤單個細胞的生長情況，提供單克隆的數(shù)字驗證數(shù)據(jù)。
CloneSelect Imager為研究人員提供了一個在半固體培養(yǎng)基中對細胞進行成像的方法。這個系統(tǒng)使用非侵入性檢測方法，無需標記細胞直接進行成像，可以對細胞生長情況進行準確定量；進行單細胞來源克隆驗證，確保只選擇穩(wěn)定的單克隆用于下游研究。本文通過實際實驗驗證CloneSelect Imager在CloneMedia™ CHO Growth A半固體培養(yǎng)基中對懸浮CHO-s細胞的成像性能。這種半固體培養(yǎng)基成份經(jīng)過專門優(yōu)化，適合各種CHO細胞系的生長。
Figure 1：有限稀釋鋪板的96孔板同一個孔CHO-s細胞成像圖片：使用CloneSelect Imager系統(tǒng)每隔8小時對微孔板進行一次成像。僅僅只是常規(guī)的實驗操作，細胞已經(jīng)在兩次成像之間發(fā)生了移動，黃色標記的是細胞的位置。
實驗操作流程
CHO-s細胞培養(yǎng)和成像的操作流程如Figure 2所示。
Figure 2：使用CloneMedia CHO Growth A半固體培養(yǎng)基追蹤單個細胞生長實驗總體流程圖。XP Media CHO Growth A和CloneMedia CHO Growth A兩種培養(yǎng)基提供了一個穩(wěn)定的CHO細胞培養(yǎng)、克隆和篩選的方法；使用CloneSelect Imager進行成像可以進行單克隆的驗證和細胞生長的追蹤。
CHO-s細胞首先使用XP Media™ CHO Growth A液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)（貨號 K8860），培養(yǎng)前添加4mM谷氨酰胺，37°C培養(yǎng)。然后，CHO-s細胞被鋪到半固體培養(yǎng)基CloneMedia CHO Growth A（貨號 K8810），鋪板密度為500 cells/ml。細胞混勻后按照2ml/well分裝到6孔板（Greiner catalog# 657185）。同時也可以加入直徑10uM的無菌微珠（Thermo Scientific catalog# G1000B）到半固體培養(yǎng)基中作為成像位置的參照。加入微珠不是上述CHO-s半固體培養(yǎng)過程的必需步驟。
其中，A1孔要加入2ml 50000cells/ml的細胞懸液作為對焦的參照孔，方便確定正確的對焦值。其他的孔各加入2ml 500 cells/ml細胞懸液，然后，200 x g離心5分鐘，37°C培養(yǎng)。
CHO-s細胞成像
使用CloneSelect Imager在多個時間點對微孔板進行成像，以提供單克隆的數(shù)字圖片證據(jù)以及追蹤細胞生長。每塊板分別在Day 0、1、2、7和8幾個時間點進行成像。對于Day 0天的成像，微孔板要先在37°C培養(yǎng)4個小時。成像時，先針對A1孔使用autofocus功能，軟件自動尋找最優(yōu)的對焦值，獲得整塊板最優(yōu)的成像效果（如Figure 3）。而且，這個對焦值會自動被記錄，相同的對焦值會用于其他時間點的成像過程。
Figure 3：CloneSelect Imager系統(tǒng)設(shè)置對焦值（A）對焦設(shè)置軟件界面，Auto Focus按鈕用于自動設(shè)置對6孔板CHO-s細胞成像的最優(yōu)對焦值。（B）使用Auto Focus功能，獲得的A1孔細胞成像圖片。
結(jié)果
CHO-s細胞可以在CloneMedia CHO Growth A半固體培養(yǎng)基中生長，形成緊致的球形克隆，非常容易識別。細胞種植密度為500 cells/ml，每孔形成的單個克隆數(shù)目在Day8天可以清晰辨認（Figure 4A和4B）。使用半固體培養(yǎng)基有利于單個孔生長出多個獨立的克隆，相對有限稀釋，需要的微孔板和培養(yǎng)基的數(shù)目大大節(jié)省。
Figure 4：CloneSelect Imager系統(tǒng)成像獲得的CloneMedia CHO Growth A半固體培養(yǎng)基中CHO-s細胞圖片：（A）種植密度為500 cells/ml的CHO-s細胞在Day 8天成像獲得的整孔圖片。（B）孔中部分克隆的放大圖片，可以清晰分辨出單個克隆。黃色圈（A）指示的是圖B放大顯示的部分。
使用CloneSelect Imager軟件可以放大單個克隆，通過鏈接不同時間點的克隆圖片可以追蹤克隆的生長，驗證克隆是否為單克隆。如Figure5 所示，顯示了兩個克隆的圖片。通過 比對兩個克隆不同時間點的生長情況，追蹤到Day0天時圖片，可以確定克隆是否生長于單個或多個細胞。半固體培養(yǎng)基額外加入的微珠（黃色圈標識）可以作為成像位置的參照，以確定每次成像的都是相同的克隆。
Figure 5： CloneMedia CHO Growth A半固體培養(yǎng)基中CHO-s細胞圖片：CloneSelect Imager對6孔板在多個時間點成像。在Day 0 天，如圖所示可以清晰觀察到上圖為一個細胞，下圖為兩個細胞。黃色圈標出的是微珠的位置，用于作為位置參照以確定每次成像的都是同一個克隆
結(jié)論
相比使用液體培養(yǎng)基進行有限稀釋，使用CloneMedia CHO Growth A半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細胞是一個更加高效準確的克隆方法。半固體培養(yǎng)基可以固定細胞的位置，在常規(guī)實驗操作過程中，不會影響細胞發(fā)生位置移動。這種方法可以更加準確地追蹤單個細胞生長為一個克隆。雖然CloneSelect Imager通常用于液體培養(yǎng)基中細胞的成像，但是也可以用于對半固體培養(yǎng)基中細胞的成像，提供了一個更加準確的工具用于追蹤細胞的生長以及驗證單克隆。
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