量子點(diǎn)活細(xì)胞成像應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方案建議

    量子點(diǎn)（Quantum dot, QD）是一種新型熒光納米材料，又稱半導(dǎo)體納米晶，呈近似球形，三維尺寸在2-10nm，具有明顯的量子效應(yīng)，其物理、光學(xué)、電學(xué)特性優(yōu)于傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料，是新一代熒光標(biāo)記探針的優(yōu)質(zhì)選擇。

    Chan等將量子點(diǎn)與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料進(jìn)行了光學(xué)特性的比較，發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)的熒光亮度是傳統(tǒng)熒光染料的20倍、量子點(diǎn)的光穩(wěn)定性是傳統(tǒng)熒光染料的100倍。但是，量子點(diǎn)作為無機(jī)合成的納米材料，其大小、化合價(jià)以及細(xì)胞內(nèi)遞送等方面也存在一定的局限性。建議研究者根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，綜合考慮量子點(diǎn)的光學(xué)特性和物理化學(xué)特性，選擇合適的量子點(diǎn)細(xì)胞標(biāo)記方法。本文綜合了量子點(diǎn)在活細(xì)胞成像研究中的相關(guān)技術(shù)，以供研究者參考。

一、量子點(diǎn)與傳統(tǒng)熒光染料的比較

1. 熒光亮度：單個(gè)量子點(diǎn)比絕大多數(shù)單個(gè)有機(jī)熒光染料的光亮度強(qiáng)，可多出數(shù)個(gè)數(shù)量級（Wu et al, 2003）。

2. 光譜特性：與傳統(tǒng)熒光染料完全不同，量子點(diǎn)的激發(fā)光譜范圍寬泛，在350nm至450nm范圍內(nèi)的紫外光及藍(lán)色光源均可激發(fā)量子點(diǎn)發(fā)光；同時(shí)，量子點(diǎn)的發(fā)射光譜非常窄，半峰寬小于30nm，而傳統(tǒng)熒光染料的半峰寬達(dá)到100nm。量子點(diǎn)上述特性使其適合同一波長的多色激發(fā)、而且多色光之間沒有相互干擾。

3. 光穩(wěn)定性及抗代謝降解能力：量子點(diǎn)的光穩(wěn)定性強(qiáng)于傳統(tǒng)熒光染料，可達(dá)數(shù)個(gè)數(shù)量級。同時(shí)，量子點(diǎn)自身的無機(jī)特性，使其具有抗代謝降解的能力，可在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定存在數(shù)周至數(shù)月，非常適合對細(xì)胞狀態(tài)和分布進(jìn)行體內(nèi)示蹤。

4. 與生物分子的耦聯(lián)：量子點(diǎn)表面積較大，除了可以耦聯(lián)靶標(biāo)分子（蛋白質(zhì)、多肽、核酸等），還可以耦聯(lián)治療藥物（如抗腫瘤藥物）和檢測試劑（如磁珠、放射性同位素等）。因此，量子點(diǎn)在分子示蹤、活細(xì)胞成像、腫瘤診斷與治療以及納米載藥等研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

5. 大小：量子點(diǎn)作為呈現(xiàn)殼-核結(jié)構(gòu)的納米材料，其核心的大小一般是3~10nm，其表面需要包被、修飾及水化處理。商品化的量子點(diǎn)一般都大于20nm，該大小的量子點(diǎn)適合在體標(biāo)記組織（如前哨淋巴結(jié)、腫瘤等）或示蹤細(xì)胞，但是對于標(biāo)記單個(gè)生物分子，則不利于單分子的細(xì)胞內(nèi)遷移和軌跡示蹤，需要定制粒徑更小的量子點(diǎn)。

6. 化合價(jià)：目前商品化的量子點(diǎn)都是以多價(jià)偶聯(lián)方式在其表面結(jié)合多個(gè)分子，但是，單分子成像與示蹤需要進(jìn)行單分子標(biāo)記，目前在量子點(diǎn)表面以單價(jià)偶聯(lián)方式進(jìn)行單分子標(biāo)記尚未商品化、需要專門定制。

7. 細(xì)胞內(nèi)遞送：量子點(diǎn)的大小及無機(jī)特性使其難于進(jìn)入細(xì)胞，量子點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)傾向于聚集，不利于細(xì)胞內(nèi)分子成像與示蹤的應(yīng)用。目前，已有相關(guān)輔助試劑或應(yīng)用細(xì)胞穿膜肽等技術(shù)，從而提高量子點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞的效率、并保持量子點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)的均勻分布。

二、細(xì)胞標(biāo)記方法

量子點(diǎn)可以標(biāo)記細(xì)胞膜表面分子和細(xì)胞內(nèi)分子，其中對細(xì)胞膜表面分子的標(biāo)記更為簡單易行。如果研究者的實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑槭聚櫦?xì)胞或組織，或是研究細(xì)胞表面受體，只需將量子點(diǎn)與膜表面分子進(jìn)行標(biāo)記；而如果研究者的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘聚櫦?xì)胞內(nèi)的分子，在標(biāo)記之外，尚需考慮量子點(diǎn)標(biāo)記物的細(xì)胞內(nèi)遞送方法。關(guān)于細(xì)胞標(biāo)記和細(xì)胞內(nèi)遞送的方法總結(jié)如下：

1. 細(xì)胞表面分子的標(biāo)記

方法一：量子點(diǎn)與膜表面分子的抗體或配體耦聯(lián)

①量子點(diǎn)純化；

②確定靶細(xì)胞表面的目標(biāo)分子，以其抗體或配體與量子點(diǎn)耦聯(lián)；

③將上述抗體/配體-量子點(diǎn)偶聯(lián)物，與細(xì)胞孵育（建議4℃孵育，以減少細(xì)胞對量子點(diǎn)的內(nèi)吞）。

優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞標(biāo)記步驟少，只需抗體/配體-量子點(diǎn)耦聯(lián)物與細(xì)胞的一步孵育反應(yīng)。

缺點(diǎn)：針對不同的抗體或配體，需要摸索不同的量子點(diǎn)耦聯(lián)方法；同時(shí)，某些抗體或配體可能難以進(jìn)行有效耦聯(lián)。

方法二：通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)對膜表面分子的標(biāo)記

①鏈霉親合素-量子點(diǎn)純化；

②確定靶細(xì)胞表面的目標(biāo)分子，將其抗體或配體進(jìn)行生物素化處理；

③將生物素化的抗體或配體，與細(xì)胞孵育；

④以培養(yǎng)基或合適的緩沖液清洗細(xì)胞，去除過量的生物素化的抗體或配體；

⑤將鏈霉親合素-量子點(diǎn)，與細(xì)胞孵育（建議4℃孵育，以減少細(xì)胞對量子點(diǎn)的內(nèi)吞）。

優(yōu)點(diǎn)：對抗體或配體進(jìn)行生物素化處理簡單易行；同時(shí)，鏈霉親合素-生物素系統(tǒng)具有信號放大作用。

缺點(diǎn)：細(xì)胞標(biāo)記步驟較多，需要兩步孵育反應(yīng)。

2. 細(xì)胞內(nèi)分子的標(biāo)記

上述標(biāo)記細(xì)胞表面分子的方法，均可用于標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)分子，即：標(biāo)記形成抗體/配體-量子點(diǎn)偶聯(lián)物或生物素-鏈霉親和素-量子點(diǎn)系統(tǒng)。但是與細(xì)胞表面標(biāo)記不同，對于細(xì)胞內(nèi)分子的標(biāo)記，尚需考慮量子點(diǎn)偶聯(lián)物的細(xì)胞內(nèi)遞送問題，具體遞送方法總結(jié)如下，以供研究者參考。

方法一：細(xì)胞直接內(nèi)吞量子點(diǎn)

• 將水溶性量子點(diǎn)與細(xì)胞共孵育數(shù)小時(shí)；
• 以合適的培養(yǎng)基或緩沖液洗去過量的量子點(diǎn)。

對于不同的細(xì)胞，其內(nèi)吞能力不同，需研究者對量子點(diǎn)的用量和孵育時(shí)間進(jìn)行摸索。同時(shí)，上述量子點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞后，存在于內(nèi)吞體中。

方法二：通過陽離子脂質(zhì)體遞送量子點(diǎn)入胞

• 制備并純化帶負(fù)電荷的量子點(diǎn)（如表面羧基化修飾的量子點(diǎn)）；
• 在無血清培養(yǎng)基中與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine2000或FuGENE6）共孵育（詳細(xì)步驟參見轉(zhuǎn)染試劑說明書）。

該方法在腫瘤細(xì)胞中適用良好，但是對于不同的細(xì)胞、不同的轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染能力和效率可能不同，需研究者對試劑用量和孵育時(shí)間進(jìn)行摸索。

方法三：通過胞飲作用遞送量子點(diǎn)入胞

Invitrogen（Life technologies）公司試劑——Influx pinocytic cell-loading reagent（I14402），通過胞飲囊泡的滲透性裂解，將水溶性量子點(diǎn)遞送入活細(xì)胞。以該方法進(jìn)入細(xì)胞的量子點(diǎn)，在細(xì)胞內(nèi)分布均勻，沒有聚集成團(tuán)的現(xiàn)象、不形成胞內(nèi)體。該方法周期約30min，可通過重復(fù)加載來增強(qiáng)量子點(diǎn)入胞的量，同時(shí)可以再生而重復(fù)利用。該方法不會對細(xì)胞造成物理破壞，比顯微注射簡單，同時(shí)不會改變細(xì)胞活力、不會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶的釋放。詳細(xì)步驟參見試劑說明書。

方法四：通過穿膜肽協(xié)助量子點(diǎn)入胞

細(xì)胞穿膜肽（Cell-Penetrating Peptides, CPP）又稱PTDs（Protein Transduction Domains），包含大量堿性氨基酸，主要來源于HIV-1的Tat蛋白，其中多聚精氨酸（Polyarginine）較多聚賴氨酸/組氨酸/鳥氨酸等更高效，最高效的是含octa-arginine或nona-arginine（R9）的多肽。CPP的穿膜作用不依賴于其它分子或耗能途徑，幾乎沒有細(xì)胞毒性。CPP可將直徑達(dá)到200nm的物質(zhì)遞送入細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)研究顯示，富含精氨酸的CPPs可向細(xì)胞內(nèi)遞送蛋白質(zhì)、DNA、RNA以及量子點(diǎn)。

CPPs與量子點(diǎn)的連接方式包括共價(jià)偶聯(lián)及非共價(jià)偶聯(lián)，而且CPPs可同時(shí)遞送共價(jià)及非共價(jià)偶聯(lián)物進(jìn)入細(xì)胞。量子點(diǎn)與CPPs的共價(jià)偶聯(lián)，是基于量子點(diǎn)表面的不同活性基團(tuán)，利用BS、EDC、sulfo-SMCC、NHS-PEO4-MAL等交聯(lián)試劑形成量子點(diǎn)-CPP偶聯(lián)物；同時(shí)，可以通過生物素-親和素系統(tǒng)、靜電相互作用、金屬親和作用等方法，實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)與CPPs的非共價(jià)偶聯(lián)�？傊�，針對不同的多肽和實(shí)驗(yàn)需求，需要研究者進(jìn)行必要的選擇和實(shí)驗(yàn)探索，更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法請參見相關(guān)文獻(xiàn)。

方法五：顯微注射

玻璃毛細(xì)管具有亞微粒級別的尖頭，可將量子點(diǎn)于局部直接注入細(xì)胞。該方法中，量子點(diǎn)用量很少（1-10pmol），對細(xì)胞的生理特性和發(fā)育沒有明顯影響。

其它方法：

如：刮擦加載量子點(diǎn)入胞，崩潰細(xì)胞膜直接將量子點(diǎn)載入細(xì)胞漿，電穿孔，低滲休克等，詳見相關(guān)文獻(xiàn)。

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