PWP1在調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用

研究背景

    胚胎干細(xì)胞具有自我更新和分化的全能性。但是，胚胎干細(xì)胞發(fā)育分化的分子機(jī)制目前還不是很清晰。研究胚胎干細(xì)胞調(diào)控機(jī)制有助于對(duì)胚胎的形成及胚胎發(fā)育相關(guān)的疾病有更深入了解。來(lái)自同濟(jì)大學(xué)的研究人員通過(guò)在小鼠胚胎干細(xì)胞中研究一個(gè)WD-4蛋白——PWP1，為我們展現(xiàn)了該基因在調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中的重要作用。

研究思路

1.PWP1影響了胚胎干細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的哪個(gè)階段呢？

     胚胎干細(xì)胞有著活躍的細(xì)胞增殖和自我更新活動(dòng)。Pwp1作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子，在胰腺癌中異常表達(dá)，為了探究Pwp1基因在胚胎干細(xì)胞中的影響，研究人員首先在胚胎干細(xì)胞（mESCs）和胚胎纖維母細(xì)胞（MEFs）中檢測(cè)了Pwp1及全能性markers基因的表達(dá)。結(jié)果顯示Oct4,Sox2和Nanog在MEFs中比mESCs中低，Pwp1在分化的ESCs中表達(dá)降低。為了研究Pwp1降低引起的細(xì)胞變化，研究人員構(gòu)建了knowdown的ESCs細(xì)胞系shPwp1 A和shPwp1 B。結(jié)果顯示，Pwp1 KD沒(méi)有改變細(xì)胞的形態(tài)和堿性磷酸酶活性，多能性markers基因的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，只有Rex1和Klf4表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞增殖檢測(cè)表明Pwp1 KD后也沒(méi)有發(fā)生明顯變化，mES二次克隆形成也沒(méi)有在Pwp1 KD后有所抑制。因此，細(xì)胞中Pwp1 KD沒(méi)有影響ESCs細(xì)胞的增殖或自我跟新過(guò)程。
    既然Pwp1不影響ESCs細(xì)胞的增殖，那么是否會(huì)影響其分化過(guò)程呢？結(jié)果顯示，Pwp1 KD后的細(xì)胞更偏向于保持在克隆形態(tài)，即ESC分化顯著降低。qRT-PCR檢測(cè)顯示3個(gè)胚芽層相關(guān)基因的表達(dá)也明顯低于對(duì)照。因此，Pwp1基因影響了ESCs細(xì)胞的分化過(guò)程。為了更嚴(yán)格的說(shuō)明Pwp1的分化作用，研究人員在畸胚瘤模型進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果過(guò)顯示，Pwp1 KD后不能檢測(cè)到明顯的胚芽層。因此，Pwp1對(duì)mES 分化非常重要。

     細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡也是mESCs自我更新的重要過(guò)程。Pwp1 KD是否影響了細(xì)胞周期和凋亡而影響細(xì)胞分化呢？結(jié)果顯示，Pwp1 KD后細(xì)胞周期沒(méi)有顯著改變，PCNA蛋白水平也沒(méi)有明顯變化，細(xì)胞周期相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)也沒(méi)有變化。同時(shí)，細(xì)胞凋亡在Pwp1 KD后沒(méi)有明顯變化。因此，Pwp1不是通過(guò)細(xì)胞周期或凋亡影響mESC的分化過(guò)程。

2. PWP1通過(guò)影響哪些下游通路調(diào)控mESC細(xì)胞分化呢？

     既然Pwp1 KD影響了ESCs的分化過(guò)程，那么，具體調(diào)控的基因是誰(shuí)呢？研究人員選擇了Aglient全基因組表達(dá)譜芯片（該服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供）作為篩選工具進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)對(duì)EBDay 0, EBDay 3和EBDay 6的Pwp1 KD組與對(duì)照組比較差異基因，分別用GSEA篩選三個(gè)不同胚芽層基因后發(fā)現(xiàn)，中胚層和內(nèi)胚層基因顯著下調(diào)。同時(shí)，Pwp1 KD中的分化相關(guān)markers基因表達(dá)也顯著比對(duì)照低。

     Pwp1是通過(guò)調(diào)控了下游哪些通路影響分化過(guò)程呢？通過(guò)對(duì)基因芯片篩選到的差異基因進(jìn)行GSEA通路分析，發(fā)現(xiàn)Jak/Stat3和Wnt/β-Catenin信號(hào)通路顯著改變。qRT-PCR和Western blotting驗(yàn)證顯著Stat3表達(dá)顯著增加，同時(shí)其下游基因Klf4,c-Myc和Socs3的表達(dá)也顯著增加。Wnt信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)降低，而Gsk3β等該通路調(diào)控基因表達(dá)并沒(méi)有顯著變化。因此，Pwp1可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，特別是Jak/Stat3通路影響了ESCs細(xì)胞的全能性。

    為了驗(yàn)證Jak/Stat3和Wnt/β-Catenin通路對(duì)ESCs分化的調(diào)控作用，研究人員分別用Jak/Stat3抑制劑AG490和Gsk3β抑制劑SB216763處理Pwp1 KD和對(duì)照細(xì)胞系。結(jié)果顯示，AG490（30 uM）恢復(fù)了細(xì)胞的分化形態(tài)，而SB216763沒(méi)有顯著影響。mRNA和蛋白檢測(cè)顯示這兩個(gè)通路基因沒(méi)有變化。磷酸化檢測(cè)顯示STAT3在AG490處理后顯著減少。為了更加深入的研究Pwp1調(diào)控Stat3的作用機(jī)制。研究人員在Pwp1 KD 細(xì)胞系中敲除了Stat3。結(jié)果顯示，細(xì)胞分化抑制被消除了。因此，Pwp1可能是通過(guò)調(diào)控下游Stat3的表達(dá)而影響分化過(guò)程。

3. Pwp1是怎么樣通過(guò)Stat3信號(hào)通路調(diào)控ESCs分化過(guò)程呢？
    
   已有研究表明，WD-40蛋白調(diào)控了H3K4的甲基化過(guò)程。結(jié)果顯示Pwp1 KD也減少了細(xì)胞中的H4K20me3的表達(dá)水平。Dox處理實(shí)驗(yàn)表明H4K20me3顯著下調(diào)，免疫組化實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證H4K20me3在Pwp1 KD后顯著下調(diào)。此外，PWP1 ChIP-seq鑒定到5,639個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，與H4K20me3 ChIP-seq的結(jié)果一致。免疫共沉淀表明PWP1和H4K20me3能結(jié)合。ChIP-PCR結(jié)果顯示，PWP1和H4K20me3都可以和Stat3 DNA序列上的上游的兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合。因此，該結(jié)果表明通過(guò)與H4K20me3結(jié)合，PWP1靶定到Stat3的上游抑制了它的表達(dá)。

研究結(jié)論

    該研究表明，Pwp1蛋白，在mESCs分化過(guò)程中扮演了重要的角色。通過(guò)表達(dá)譜芯片篩選，GSEA通路分析和后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證找到了下游調(diào)控基因Stat3。進(jìn)一步的ChIP-seq等實(shí)驗(yàn)表明PWP1與H4K20me3相互作用，結(jié)合到Stat3上游位點(diǎn)影響了Stat3的表達(dá)，最終影響了ESCs的早期分化過(guò)程。

個(gè)人點(diǎn)評(píng)
    
    該研究是典型的基因功能分子機(jī)制研究。當(dāng)我們想研究某一個(gè)基因在某個(gè)生物學(xué)過(guò)程中的作用時(shí)，第一步就是確認(rèn)該基因引起的生物學(xué)表型。接下來(lái)一步就是下游功能基因的篩選，通過(guò)基因過(guò)表達(dá)和敲除細(xì)胞系，借助于高通量基因芯片或者二代測(cè)序手段，篩選下游差異表達(dá)基因。最后通過(guò)生物通路分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工作來(lái)揭示某基因是怎么樣具體通過(guò)調(diào)控了下游的基因，進(jìn)而影響了某個(gè)生物學(xué)過(guò)程。而這樣一種思路的研究一般能發(fā)表5分以上的高影響因子文章，因此非常值得大家借鑒參考。

原文出處：

Shen JW, Jia WW, Yu YY, Chen J, Cao XK, Du YH, Zhang XB, Zhu SC, Chen W, Xi JJ, Wei TY, Wang GY, Yuan DL, Duan T, Jiang CZ,Kang JH. Pwp1 Is Required for the Differentiation Potential of Mouse Embryonic Stem Cells Through Regulating Stat3 Signaling. Stem cells2015;33:661–673.