細(xì)胞轉(zhuǎn)染的途徑與方法

瀏覽次數(shù)：5212　發(fā)布日期：2016-4-25　來(lái)源：南京厚百電子商務(wù)有限公司

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù),它是研究基因表達(dá)調(diào)控，突變分析等的常規(guī)工具。細(xì)胞轉(zhuǎn)染分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體上，不整合到細(xì)胞的染色體上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指DNA整合到宿主細(xì)胞的染色體中。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染途徑

（一）物理介導(dǎo)：電穿孔法、顯微注射、基因槍

1. 電穿孔法：

電穿孔靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。本法需用特殊設(shè)置（電穿孔儀），把懸浮狀態(tài)的受體細(xì)胞和供體DNA共同放入皿中（或杯中），再施以高壓電脈沖，能夠促進(jìn)DNA通過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入胞內(nèi)，并可整合到細(xì)胞的DNA中，使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。若轉(zhuǎn)移的DNA為帶有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，也可在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行鑒定。

優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率較高

缺點(diǎn)：

1）需要昂貴的儀器（電穿孔儀）

2）對(duì)細(xì)胞的損害較大，每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA

3）每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化：電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆轉(zhuǎn)地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。

2. 顯微注射

本法是借助顯微注射器直接把DNA注射入核內(nèi)，使之發(fā)生整合入受體細(xì)胞基因組中的技術(shù)。本技術(shù)需要有嚴(yán)密無(wú)菌的凈化室，以免敞開(kāi)操作污染，同時(shí)要能有自動(dòng)拉針儀以制備顯微針，一般用手動(dòng)拉針器拉制時(shí)要能使針末端有一個(gè)0.6cm長(zhǎng)的細(xì)部，太長(zhǎng)易折斷，針尖開(kāi)口為2-3μm間，針口小于1μm更佳，針尖開(kāi)口大于5μm易刺傷細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率較高，可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

缺點(diǎn)：在導(dǎo)入DNA時(shí)需要一個(gè)細(xì)胞一個(gè)細(xì)胞注射，不適合大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞研究的需要。適用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

3. 基因槍

基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。可以將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。

（二）化學(xué)介導(dǎo)：磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)

1. 磷酸鈣共沉淀法

磷酸鈣被認(rèn)為有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面的結(jié)合。氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混合，形成極小的磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對(duì)于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。

優(yōu)點(diǎn)：能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動(dòng)物，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染都可以。

缺點(diǎn)：

1）轉(zhuǎn)染效率低：進(jìn)入細(xì)胞的DNA只有1%-5%可以進(jìn)入細(xì)胞核，其中只有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。

2）重復(fù)性不佳：pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞孵育時(shí)間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。

在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x最優(yōu)條件的十分之一pH都會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失敗。

2. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體則不同，DNA并沒(méi)有欲先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過(guò)內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。

脂質(zhì)體（lipofectin regeant，LR）試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體N-[1-2,3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1(w/w)]。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)：

1）適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

2）轉(zhuǎn)染效率高，比磷酸鈣法高5-100倍。

3）能夠把DNA盒RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。

4）轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高。

5）轉(zhuǎn)染時(shí)最好不加血清和抗生素。

6）陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對(duì)較高，對(duì)部分細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝。

3. 多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)

DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，原理尚不清楚，可能是通過(guò)內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。不適用與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)要除去血清。

（三）生物介導(dǎo)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，以病毒作為載體，通過(guò)病毒感染的方式將外源DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染體系最為常用。

優(yōu)點(diǎn)：整合效率高，可使外源基因在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)。適用于難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞。

缺點(diǎn)：存在潛在的安全危險(xiǎn)性。

1. 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

此系統(tǒng)包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細(xì)胞兩個(gè)部分。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)入包裝細(xì)胞系時(shí)，載體基因就被包裝形成完整的病毒顆粒，于是包裝細(xì)胞系就成了制造病毒載體的生產(chǎn)細(xì)胞系。將靶細(xì)胞與生產(chǎn)細(xì)胞系共同培養(yǎng)或是收集含有載體病毒的生產(chǎn)細(xì)胞系上清液與靶細(xì)胞一起孵育，即可有效地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。可以有效地整合入靶細(xì)胞基因組并穩(wěn)定持久地表達(dá)所帶的外源基因。

優(yōu)點(diǎn)：

1）轉(zhuǎn)染譜廣，可感染包括人體在內(nèi)的多種動(dòng)物細(xì)胞類型

2）一次可感染大量細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率可高達(dá)100%

3）轉(zhuǎn)染的基因能夠準(zhǔn)確整合到宿主細(xì)胞基因組中，整合率高，且能長(zhǎng)期有效表達(dá)。

缺點(diǎn)：

1）載體的滴度較低

2）只能整合表達(dá)至分裂相細(xì)胞

3）容納的外源基因量較少，不利于較大基因的插入（<8kb）

2. 腺病毒載體的特點(diǎn)

1）在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因

2）能有效進(jìn)行增殖，滴度高

3）不整合到染色體中，一般用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染