長期社會隔離對雌性大鼠行為生理的影響

摘要:為研究社會隔離能否導致雌性嚙齒動物產(chǎn)生焦慮，將成年雌性大鼠分別進行單獨隔離飼養(yǎng)(單養(yǎng))和四只一籠群養(yǎng)，十周后進行行為學和生理測試。行為結(jié)果顯示:與群養(yǎng)組相比，單養(yǎng)組大鼠在曠場中的直立次數(shù)減少，明暗箱測試中的暗箱停留時間增長，穿越次數(shù)減少;說明長期社會隔離使雌鼠產(chǎn)生了焦慮。雖然兩組大鼠與應激和生殖相關的生理器官重量沒有差異，但單養(yǎng)組血清皮質(zhì)醇和孕酮水平比群養(yǎng)組低，說明長期社會隔離導致雌鼠下丘腦唾體一腎上腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)異常，可能會對雌鼠的生殖生理帶來不利影響。

關鍵詞:社群隔離;雌性大鼠;焦慮行為;血液激素;生理指標

正常的社會關系對生物個體的健康有著重要意義，一旦遭到破壞將對機體帶來消極影響。長期社會隔離對群居動物來說是一種生存應激。這種應激模型為研究人類精神疾病提供了很好的切入點，被廣泛用于人類精神障礙疾病的發(fā)病機制、新藥研發(fā)和預防等的研究。

社會隔離能使群居動物腦的形態(tài)、激素水平以及神經(jīng)化學通路發(fā)生改變，進而使該動物表現(xiàn)出異常的行為和生理特征。以往研究發(fā)現(xiàn)長期社會隔離會導致嚙齒動物多動，攻擊行為增加困，在新環(huán)境中缺乏正常的習慣化行為，前脈沖抑制(prepulse inhibition, PPI)缺失等。然而，社會隔離對嚙齒動物的影響受到很多因素的制約，與被測動物的性別年齡、品系以及隔離持續(xù)的時間均有關系。例如，社會隔離能使成年的雌性小鼠(M。musculus)'腎上腺肥大，動情周期縮短，使成年雌性大倉鼠(Tscheskia triton)的卵巢和子宮增大，但是對雄性大鼠(Rattus norvegicus )、雄性小鼠(Musmusculus)}和成熟的大倉鼠則沒有影響;3周齡的雄性bong Evan大鼠隔離12周可以增加其對酒精的偏好，但是在成年期進行隔離則不會出現(xiàn)此現(xiàn)象,最近的研究表明短期隔離或者每天隔離1h，持續(xù)四周會導致草原田鼠血清皮質(zhì)酮顯著升高;但是長期隔離四周則對血清皮質(zhì)酮沒有影響

社會隔離能否使鼠類產(chǎn)生脅迫和應激反應，與鼠類在自然條件下的生活方式也有密切關系少〕。研究表明單養(yǎng)對大鼠、小鼠和長爪沙鼠( Merionesunguiculatus)等群居動物會產(chǎn)生脅迫效應，引起焦慮反應而對營獨居生活的金倉鼠(Mesocricetus auratus)和大倉鼠則是有利的關于社會隔離對大鼠應激反應的影響研究尚存在爭議，比如有些研究發(fā)現(xiàn)社會隔離引起大鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(Adreno-('.orticotropic Hormone,ACTH)和皮質(zhì)酮的升高ya.zz爪有些研究中則是降低，還有些研究發(fā)現(xiàn)ACTH和皮質(zhì)酮的水平在群養(yǎng)和隔離飼養(yǎng)動物之間差異不顯著

在本研究中，我們將以成年雌性大鼠為研究對象，一定條件下，雌性的應激反應明顯高于雄性大鼠，但以往的社會隔離研究用雄鼠比較多，采用高架十字迷宮(elevated plus maze,  EPM)曠場(open field)和明暗箱(light/dark box) 3種經(jīng)典的焦慮測試方法來檢測長期社會隔離(隔離l0周)能否引起雌性大鼠的焦慮反應;皮質(zhì)醇、孕酮、雌二醇等激素水平與群養(yǎng)組大鼠是否存在差別;應激、生殖相關的腎上腺、脾臟、子宮、卵巢、包皮腺等器官重量是否發(fā)生了變化。本研究將有助于進一步加深人類對嚙齒類動物社會隔離焦慮模型的理解。

1材料與方法

1.1 動物

24只2個月齡成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，初始體重(196.3 ^-242. 6 g)，購買于北京維通牙日華實驗動物技術有限公司�？紤]到雌性SD大鼠是褐家鼠的變種，在野外屬于群養(yǎng)動物，在實驗前，4只雌鼠同籠飼養(yǎng)，買回后適應1周;每天進行陰道分泌物的涂片，觀察動情周期的變化，選擇有正常動情周期的大鼠進行后續(xù)實驗。飼養(yǎng)大鼠的房間的光暗周期是14I, / lOD，光周期逆轉(zhuǎn)(早晨08:00關燈，22:00亮燈)，室溫控制在(22士2)0C。整個實

驗期間，供給充足的食物和水，食物為標準大鼠飼料。實驗時，我們隨機將24只雌鼠分為兩組，其中12只四只同籠飼養(yǎng)，作為群養(yǎng)組，其他12只單籠飼養(yǎng)，作為社會隔離組。標準大鼠塑料飼養(yǎng)籠(37 cmX 26 cmX 17 cm)內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)10周。

為了排除動情對行為和激素結(jié)果的影響，我們只選用非動情期大鼠的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。為了避免人為因素對大鼠行為和激素水平的影響，我們在大鼠的行為測試和取血樣之后檢查其陰道分泌物涂片，確定其動情狀態(tài)。動情期大鼠陰道分泌物全部是無核角質(zhì)化細胞或間有少量上皮細胞。

1. 2行為測試

所有的行為測試都是在光線較暗的安靜的房間進行。測試時間為9:30-16:30(大鼠光周期的暗相)。行為測試時，按照高架十字迷宮、曠場和明暗箱的順序依次測定，每只鼠每天只進行一次測試。

1. 2. 1高架十字迷宮 高架十字迷宮由上海欣軟信息科技有限公司提供，包括兩個開放臂(45 cm X 10 cm)、兩個封閉臂(45 cm X 10 cm X40 cm)以及10 cm X 10 cm的中心區(qū)域，封閉臂和開放臂交叉呈十字形，整個迷宮距離地而74 cm。被測大鼠在測試前先在測試的房間中適應30 min,測試時有正常的燈光照明。將被測大鼠放在中心區(qū)域(頭朝向開放臂)，讓其自由探索5 min。每只大鼠在迷宮中的活動情況由攝像機拍攝記錄，然后由對實驗處理不知情者對錄像進行觀察，統(tǒng)計動物進入開放臂和封閉臂的次數(shù)(四肢均進入臂內(nèi))，以及分別在開放臂和封閉臂內(nèi)停留的總時間。

1.2.2曠場   曠場由上海欣軟信息科技有限公司提供，大小為75 cmX 45 cmX 35cm的有機玻璃制成的箱子(無蓋)，將其底板平均劃分成15個15 cm X 15 cm的格子，中間的3個方格稱為中央格。實驗開始時，將被測鼠輕輕放在曠場一角的格子中(朝向角落)，讓其自由探測10 min，攝像機記錄其在此時間段內(nèi)的所有行為。統(tǒng)計的指標如下:水平運動能力(所穿越的格子數(shù))、直立次數(shù)(后肢站立，前爪騰空或扶趴曠場壁的次數(shù))、中心時間(在中心格中停留的時間)以及潛伏期(從放入到第一次離開角落格子的時間)和休息時間(四肢站立不動)。

1.2.3明暗箱  明暗箱由上海欣軟信息科技有限公司提供，由兩個規(guī)格為35 cm X 25cm X 17 cm的塑料箱組成，中間通過錫鐵皮管(長5cm，直徑為5. 5 cm)相連。其中一箱用透明的有機玻璃板覆蓋，并在盒蓋上方30 cm處放置40 W的燈泡提高亮度，作為明箱;另一箱則用硬紙板密封，阻比光線進入，作為暗箱。測試時，將待測鼠放入明箱的中心區(qū)域，任其在明箱和暗箱中自由探究5min。所統(tǒng)計的參數(shù)包括:潛伏期(從放入到第一次離開明箱所需要的時間)，明箱中累積時間、暗箱中累積時間(四肢均進入時，認為是進入)和兩箱之間的穿越頻次。

每只動物測試完畢，實驗人員都對所使用的迷宮進行擦拭清洗(先用75%的酒精，然后用水)，并用吹風機吹干，以避免前一只大鼠的遺留氣味影響

之后待測大鼠的焦慮行為水平。

1. 3器官解剖和血液激素的測定

處理10周后，在上午9: 30-10: 00，采用斷頭的方法處死兩組試驗鼠,3 min內(nèi)收集軀干血。血樣在4 000 r/min, 4℃下離心30 min，取得血清。將血清保存在一2 0 0C，以備進行皮質(zhì)醇、孕酮和雌二醇的測定。然后，解剖大鼠的腎上腺、脾臟、卵巢、子宮和包皮腺并稱重，精確到0. 1 mg。相對器官重量通過下而的公式計算相對器官重一絕對器官重(g) X100/體重(g) 0血清樣品的激素含量采用Iz} 1放射性免疫測定的方法進行測定。激素測定所用的試劑盒均由北京科美東雅生物技術有限公司提供。人類的抗血清具有高度特異性;對所有標準的激素來說，人類抗血清與其他的類固醇激素發(fā)生交叉反應的可能性小于0.0100;內(nèi)部和相互反應的可變性小于7. 4%和10. 0%。

1. 4數(shù)據(jù)分析

首先要采用單樣本KS檢驗法對所測得的數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗。對于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用雙尾獨立樣本T檢驗;對于非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，則采用Mann Whitney U檢驗進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)都用SPSS 18. 0進行統(tǒng)計分析，顯著水平定為a=0. 05。

2結(jié)果

2 .1高架迷宮實驗

隔離飼養(yǎng)和群養(yǎng)大鼠在高架十字迷宮測試中的行為沒有表現(xiàn)出顯著差異(表m1)

2. 2曠場實驗

與四只一籠的群養(yǎng)雌鼠相比，單養(yǎng)的雌鼠在曠場中直立次數(shù)明顯減((t=2.543,P=0.023)，其他行為沒有顯著差異。中間格子的停留時間是情緒的重要指標，雖然從平均值來看，兩者有較大差別，但數(shù)據(jù)是非正態(tài)分布，采用Mann Whitney U檢驗進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示群養(yǎng)組和單養(yǎng)組之間并沒有顯著差異(二=0.221,P=0.833)(表2)

2. 3明暗箱實驗

與群養(yǎng)的雌性大鼠相比留時間顯著增多(Ct= 2. 520,留時間顯著減少(Ct一2. 524,，單養(yǎng)雌鼠在暗箱中停P = 0. 047)，明箱中停P = 0. 045)，在明暗箱之間穿越次數(shù)明顯減少(總穿越頻次:t = 2. 114,P=0. 049)，潛伏期沒有差異(二=1.629,P=0.103)(表3)。

2. 4體重和器官重量變化

單養(yǎng)和群養(yǎng)雌性大鼠的試驗前初始體重沒有顯著差異((t=1.290,P=0.210)，但隔離飼養(yǎng)

第1周后，與群養(yǎng)組大鼠相比，單養(yǎng)組大鼠表現(xiàn)出明顯的體重增加(t=2. 570,P=0. 023)，這種

差異一直持續(xù)到隔離飼養(yǎng)的第10周(t=2. 900,P=0 .050)(圖1)。

然而，單養(yǎng)和群養(yǎng)雌鼠之間腎上腺、脾臟、子宮、卵巢和包皮腺的相對重量并沒有表現(xiàn)出顯著差異結(jié)果見表40

我們的研究結(jié)果表明長期社會隔離使雌性大鼠在曠場中的直立行為減少，在明暗箱測試中，明箱和暗箱之間穿越次數(shù)減少，并在暗箱中停留時間增加，說明雌性大鼠在長期社會隔離中產(chǎn)生了焦慮行為。這與有些早期的研究結(jié)果一致。但Helleman與Zha等的研究結(jié)果卻表明社會隔離并沒有使大鼠產(chǎn)生焦慮反應。這種差異原因可能是實驗動物品系、性別差異及實施隔離的時間不同引起的。比如，Hellemans用的是雄性I, Evan大鼠，而本實驗選用的是雌性SD品系的大鼠;Hellemans選擇在Long-evans大鼠21 d和66 d

時進行隔離，共隔離飼養(yǎng)了3個月，Zhao是在SD大鼠21天時實施的隔離，共隔離飼養(yǎng)了8周，而本實驗則是在SD大鼠成年的時候進行的隔離，共隔離飼養(yǎng)了10周。根據(jù)以前文獻報道，社會脅迫通常會減少動物在高架迷宮中開放臂停留的時間X33 3d}但令人費解的是，在高架十字迷宮測試中，我們并沒有觀察到隔離大鼠和群養(yǎng)大鼠在行為上的差異。這可能由于高架十字迷宮中的行為參數(shù)比較容易受到各種不確定測試因素的影響所致，3}};但也可能由于成年SLl雌性大鼠對曠場和明暗箱測試更加敏感，具體原因還有待進一步的驗證。

體重方而，我們發(fā)現(xiàn)與群養(yǎng)大鼠相比，社會隔離僅一周就能使雌性大鼠的體重顯著增加。這可能是因為隔離飼養(yǎng)的大鼠比群養(yǎng)的大鼠進食量更大，有研究表明，即使己經(jīng)飽食的隔離飼養(yǎng)大鼠仍然表現(xiàn)出取食行為。另一方而，體重的增加(肥胖)也是判斷嚙齒動物產(chǎn)生社會脅迫的一個重要指標

除了體重增加之外，應激、生殖器官重量及相關激素水平的變化也是動物產(chǎn)生脅迫反應比較直觀的測量指標[?17。但在我們的試驗中，群養(yǎng)組與單養(yǎng)組的腎上腺、脾臟、子宮、卵巢、包皮腺的相對重量并沒有表現(xiàn)出差異。這可能是因為稱量器官濕重很容易受到血液含量及附帶組織的干擾。激素的研究結(jié)果表明社會隔離使血清中皮質(zhì)醇和孕酮降低，表明社會隔離導致了雌鼠下丘腦唾體一腎上腺軸和下丘腦-垂體Jh}腺軸的調(diào)節(jié)異常，可能會影響到隔離鼠的代謝、繁殖和免疫等生理功能。我們雖然發(fā)現(xiàn)社會隔離使雌性大鼠出現(xiàn)了明顯的焦慮行為，但皮質(zhì)醇卻顯著下降，這種行為和激素水平不一致的現(xiàn)象，以往研究中也有出現(xiàn)，比如:高熱應激使大鼠焦慮，然而血清皮質(zhì)酮的水平卻下降.當糖皮質(zhì)激素水平是正常的時候，大鼠也常會出現(xiàn)各種焦慮行為口;創(chuàng)傷后應激會導致行為和神經(jīng)活動的改變，但尿液中皮質(zhì)醇水平卻降低比〕。這或許是因為焦慮行為和激素水平測試的結(jié)果非常依賴動物的飼養(yǎng)條件(活動空間大小、飼料)、測試環(huán)境及選擇的測試方法(依靠單一行為方法無法準確推斷實驗動物的焦慮水平);還有可能由于動物對長時期的應激刺激產(chǎn)生了適應;另外，雌性大鼠的激素水平可能與其所處的動情周期也有關系。

4結(jié)論

本文研究結(jié)果表明，社會隔離使雌性成年大鼠產(chǎn)生了焦慮行為，并引起隔離大鼠血液中皮質(zhì)醇和孕酮的下降;動物長期進化過程中形成的獨居或居的生活方式是決定動物馴化過程中適宜養(yǎng)殖條件的重要因素，人為改變其生活模式可能會對其行為和生理產(chǎn)生影響。此研究結(jié)果將有助于進一步加深人類對嚙齒類動物社會隔離焦慮模型的理解。本研究的局限性在于激素和行為的檢測雖然排除了動情期大鼠，但沒有認真區(qū)分其他動情周期比如動情間期、動情前期和動情后期之間的差別。社會隔離對處于不同動情狀態(tài)雌鼠的影響尚需要進一步研究。