Western Blot技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程

Western Blot又稱為蛋白質(zhì)印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應(yīng)的一種定量或定性檢測(cè)蛋白的實(shí)驗(yàn)方法。

基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)樣品分離，分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白，通過酶促反應(yīng)或者化學(xué)發(fā)光等方法將目標(biāo)蛋白可視化，從而對(duì)蛋白進(jìn)行定性或者定量研究。

WB技術(shù)的基本操作流程如下：

配膠  

1. 注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。

2. 分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲(chǔ)存液避光存放于4℃，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可。

3. 封膠：灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度＜10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動(dòng)。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。 

4. 灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時(shí)宜邊加水邊拔，以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正；若變形嚴(yán)重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長時(shí)間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^的膠凝時(shí)其內(nèi)部分子的排列尚未完成。   

樣品處理

1. 培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）

⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。

⑵ 對(duì)于6孔板來說每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 

⑶ 100℃，1min。  

⑷ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。  

⑸ 用干凈的針尖挑絲，如有團(tuán)塊則將團(tuán)塊棄掉，如果沒有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團(tuán)塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復(fù)抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。

⑹ 待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。 

2. 培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）

⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。

⑵ 加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10~20min。  

⑶ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。 

⑷ 12000g離心，4℃，2min。 

⑸ 取少量上清進(jìn)行定量。  

⑹ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

3. 組織

⑴ 勻漿對(duì)于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液�？墒謩�(dòng)或電動(dòng)勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。

⑵ 12000g離心，4℃，2min。

⑶ 取少量上清進(jìn)行定量。  

⑷ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

電泳  

1.上樣前將膠板下的氣泡趕走。  

2.所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1×loading buffer上樣，Marker也用1×loading buffer調(diào)整至與樣品等體積。  

3.以初始電壓為45V時(shí)的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳，當(dāng)電壓達(dá)65V時(shí)改為穩(wěn)壓電泳。 

4.在目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1cm以上結(jié)束。  

轉(zhuǎn)膜  

1.電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開始準(zhǔn)備：

濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去離子水至1,000ml。干轉(zhuǎn)則取此轉(zhuǎn)移液，每50ml加入10%SDS180ul。  

浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細(xì)作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。 

2.取膠：將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側(cè)一張（干轉(zhuǎn)每側(cè)三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路）。 

3.轉(zhuǎn)膜：

濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。  

干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。負(fù)載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。   

封閉及雜交 

1.封閉：將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時(shí)。必要時(shí)可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。 

2.結(jié)合一抗：一抗的準(zhǔn)備：使用反貼法時(shí)每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。  反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時(shí)或4℃靜置過夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發(fā)。 

3.洗滌：一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。 

4.結(jié)合二抗：根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體，按相應(yīng)比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖一小時(shí)。 

5.洗滌：二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。   

發(fā)光鑒定  

一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。 

1. HRP-ECL發(fā)光法：將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。 

2.AP-NBT/BICP顯色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個(gè) EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報(bào)紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時(shí)將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。   

√ 增強(qiáng)敏感性  

若目的條帶未出現(xiàn)，或很淡，可試用以下方法增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度：  

1.用清水漂洗膜數(shù)分鐘，重加發(fā)光液進(jìn)行曝光，可延長曝光時(shí)間。 

2.將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長，期間至少換2次液。 

3.封閉40~60min  

4.一抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會(huì)更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。 

5.PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。 

6.二抗雜交，37℃ 1h。  

7.PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。 

8.發(fā)光鑒定。  

9.若條帶仍未出現(xiàn)或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。  

10.三抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會(huì)更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時(shí)三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。 

11.PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。 

12.發(fā)光鑒定。   

√ NC膜的多次使用  

一張NC膜可使用多次，對(duì)多種蛋白進(jìn)行雜交，步驟與“七．增強(qiáng)敏感性”相近。 

1.如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置差別較大則只需用PBST洗滌掉發(fā)光液（10min×3次）后從一抗雜交開始，后續(xù)步驟同前。  

2.如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置較近則需更強(qiáng)的洗滌，可用 strip液（可用雜交袋）于室溫?fù)u動(dòng)洗滌30min~60min，然后用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，后續(xù)步驟同前。  

3.對(duì)于雜交若干次的膜，如果常規(guī)洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強(qiáng)度更強(qiáng)的自配的strip液（可用雜交袋）于50℃洗滌30min，然后用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，后續(xù)步驟同前。