幾種蛋白質(zhì)濃度測定方法介紹

 一、Bradford法

蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭染料結(jié)合生成藍(lán)色物質(zhì)，藍(lán)色物質(zhì)的量與蛋白質(zhì)濃度的高低成正比。生成的藍(lán)色物質(zhì)在595nm處有最大光吸收，通過測定595nm的光吸收，來測定蛋白質(zhì)濃度。實(shí)驗(yàn)中一般利用牛血清白蛋白(BSA)來作標(biāo)準(zhǔn)曲線，此法的靈敏度為25~200ug/ml。甘油、吐溫（tween）80、去污劑、2-巰基乙醇、乙酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris）和一些堿性緩沖液會干擾該檢測反應(yīng)，可以通過設(shè)立適當(dāng)?shù)膶φ諄硐�除這種干擾。

試劑準(zhǔn)備：

1．Bradford儲存液：95%乙醇，100mL；88%磷酸，200mL；考馬斯亮蘭G-250染料，350mg；室溫下可長期穩(wěn)定保存。

2．Bradford工作液：雙蒸水，425mL；95%乙醇，15mL；88%磷酸，30mL；Bradford儲存液，30mL；Whatman I號濾紙過濾，室溫保存于棕色瓶中，可用數(shù)周，但用前需重新過濾。

3．標(biāo)準(zhǔn)蛋白：1mg/mL牛血清白蛋白。

操作方法：

1．以PBS為空白對照，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA梯度稀釋為20ug/mL、17.5 ug/mL、15 ug/mL、12.5 ug/mL、10 ug/mL、7.5 ug/mL、5 ug/mL、2.5 ug/mL，待測樣品做適當(dāng)稀釋，每管100uL。每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)做一新的標(biāo)準(zhǔn)曲線；沒個(gè)樣品2~3個(gè)重復(fù)管。

2．加入1mL Bradford 工作液，振蕩混勻，室溫反應(yīng)2分鐘。由于染料和蛋白的反應(yīng)時(shí)連續(xù)的，所以染料應(yīng)依次加入到個(gè)蛋白樣品中，所有樣品也應(yīng)按照加入染料的順序測定A595值。

3．測定A595值，測量應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成。

4．以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，A595值為縱坐標(biāo)畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過待測樣品的A595值，確定其濃度。

二、Lowry法

 Lowry法又稱Folin-酚法，蛋白在堿性溶液中與相應(yīng)試劑形成銅-蛋白復(fù)合物，這一復(fù)合物還原Folin-酚試劑（磷鉬酸-磷鎢酸試劑），產(chǎn)生深藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物，這種深藍(lán)色復(fù)合物在745~750nm處有最大光吸收，吸光度與蛋白濃度成正比。

試劑準(zhǔn)備：

1．緩沖液A（溶液可長期保存于室溫）：CuSO4·5H2O，0.5g；Na3C6H5O7·2H2O，1g；加雙蒸水至100mL。

2．緩沖液B（溶液可長期保存于室溫）：Na2CO3，20g；NaOH，4g；加雙蒸水至1L。

3．緩沖液C：緩沖液A，1ml；緩沖液B，50mL。

4．緩沖液D：Folin-酚試劑，10mL；雙蒸水，10mL。

操作方法：

1．以蒸餾水為空白對照，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA梯度稀釋為500ug/mL、250 ug/mL、125 ug/mL、62.5 ug/mL、31.25 ug/mL，待測樣品做適當(dāng)稀釋，每管40uL。標(biāo)準(zhǔn)蛋白的選擇對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，一般應(yīng)該選擇和目的蛋白類似的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較好，比如測定抗體濃度時(shí)，選擇同種動(dòng)物IgG作為陽性對照的結(jié)果比BSA結(jié)果準(zhǔn)確。

2．加緩沖液C 200uL，混勻，室溫反應(yīng)5~10分鐘。

3．加緩沖液D 20uL，混勻，室溫反應(yīng)20~30分鐘。

4．測定A750值。做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測樣品的A750值，計(jì)算待測蛋白的濃度。

三、紫外吸收法

蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，在280nm處有最大光吸收，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值可以反映蛋白的濃度。紫外吸收法簡便、快速，但準(zhǔn)確度較差。對于含核酸的蛋白質(zhì)溶液，還應(yīng)測定其A260。

操作方法：

1．準(zhǔn)備空白對照和待測蛋白溶液。

2．調(diào)節(jié)儀器波長為280nm。

3．用空白對照調(diào)節(jié)吸光度A280為零。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿。

4．讀取待測蛋白溶液的A280。

5．調(diào)節(jié)儀器波長為260nm，用空白對照調(diào)節(jié)吸光度A260為零，讀取待測蛋白溶液的A260。

6．計(jì)算蛋白濃度：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45×A280-0.74×A260。