Western實驗中內(nèi)參基因的選擇及使用方法

Western Blot實驗常用于檢測蛋白表達(dá)量、蛋白表達(dá)產(chǎn)物的正確性等。相對于其他檢測蛋白的方法而言Western Blot實驗在蛋白的定性定量分析、與目的蛋白量的比較方面更簡單一些。

雖然，順利的時候Western blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結(jié)果啦、假陽性啦、結(jié)果出現(xiàn)多條帶啦、抗體問題啦（一抗有問題還是二抗有問題啦）……畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應(yīng)不象1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達(dá)產(chǎn)物，確實是有一定的不確定性的。所以，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?Western Blot實驗設(shè)計中要求有良好的參照體系，對實驗結(jié)果分析是非常有用。特別是當(dāng)實驗出現(xiàn)問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在，而不必抓耳撓腮怨天尤人。

良好的參照體系通常包括分子量marker(用來確定蛋白條帶對應(yīng)的分子量大小)、空白載體對照 (如果是誘導(dǎo)表達(dá)體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對照)、已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對照，另外還有內(nèi)參。內(nèi)參即是內(nèi)部參照 (Internal Control)，對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白 (Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting 實驗中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實際上內(nèi)參是最容易被忽略的一項。我們知道，要用Western Blot 比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對多少，前提條件是等量的細(xì)胞上樣，才有比較的基礎(chǔ)，特別表達(dá)量不高時，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析，所以需要內(nèi)參。在國外發(fā)表的文章中，Western Blotting 實驗結(jié)果須進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國內(nèi)仍有不少科研人員在Western Blotting實驗中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。

然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準(zhǔn)確的確定各種樣品的蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質(zhì)如DNA的干擾，且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA、Bradford、 Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford法敏感度最高，且與一系列干擾Lowry、BCA 反應(yīng)的還原劑 (如DTT，巰基乙醇) 相容，但是對去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。另外，蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實驗時使用內(nèi)參，即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。

在Western Blotting中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

在Western Blotting實驗過程中使用內(nèi)參的方法通常有以下三種。

第一種是超級簡便的標(biāo)記內(nèi)參使用法，只要在二抗孵育時加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。

第二種是普通內(nèi)參，當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測，然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

第三種，當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開，然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育，二抗溫育以及顯色。

常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我們選擇內(nèi)參與要檢測的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你檢測的蛋白的分子量來選擇合適的內(nèi)參!

actin即肌動蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin (β- non-muscle)和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論的。beta-actin作為內(nèi)參是得到了公認(rèn)的，這是針對大多數(shù)組織和細(xì)胞來說的，它廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，表達(dá)量非常豐富。GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶) 是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，而tubulin和actin類似，是細(xì)胞骨架的組成部分，但是不是肌肉的主要成分，應(yīng)該是一個代替品。三種同時發(fā)生變化的情況很少，需要具體分析。一旦出現(xiàn)上述三種內(nèi)參同時發(fā)生變化，如果是總蛋白可以用胞核的內(nèi)參如PCNA，TATA-box bingding protein (TBP) 甚至線粒體的內(nèi)參來代替，當(dāng)然一般這種可能性出現(xiàn)的幾率微乎其微。

不同異構(gòu)體表達(dá)對蛋白的檢測是有很大的影響，買抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗體雜不出條帶其實未必是抗體質(zhì)量的問題。很多公司的內(nèi)參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的beta-actin為例，有的公司選擇N-端，有的選擇C-端。選用N- 端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作為抗原制備抗體(單抗和多抗)的占大多數(shù)，這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體的主要有 Axxora PLATFORM (PSC-3777)，EPITOMICS (1784-1，1854-1等)，這類抗體可以在肌肉細(xì)胞中檢測到actin陽性信號。有時候在實驗中檢測內(nèi)參時產(chǎn)生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對造成的。

actin幾種異構(gòu)體存在組織分布特異性，不同型actin之間具有較高的序列相似性(>90%)。β-actin是分布于非肌細(xì)胞中的一種骨架蛋白，選擇作β-actin內(nèi)參時首先得保證是組織廣泛表達(dá)的(尤其是做蛋白的組織表達(dá)譜時)。那么制備β-actin抗體的抗原應(yīng)該是選用與actin其它異構(gòu)體一致的氨基酸序列。公司制備抗體是選用beta-actin的某一段小短肽作為免疫原，可能會因為選取的短肽在不同型actin之間保守與否,而導(dǎo)致所制備抗體具有一定的組織特異性.如選取的短肽僅在beta型存在,所得抗體就僅能檢測非肌細(xì)胞中的actin,而選取的短肽在六型中均存在,則此抗體除非肌細(xì)胞外，還可以檢測cardiac，skeletal，smooth muscle細(xì)胞的actin。

Western Blot實驗中選擇內(nèi)參作為參照體系對于實驗結(jié)果的分析具有很好的說明性。內(nèi)參的選擇往往使用一些常見的持家基因，常用蛋白內(nèi)參有GAPDH、beta-actin等。Western Blot實驗中內(nèi)參的選擇及其使用方法都會直接影響對實驗結(jié)果的分析。