免疫印跡western實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參基因的選擇和注意事項(xiàng)
Western Blot實(shí)驗(yàn)常用于檢測(cè)蛋白表達(dá)量、蛋白表達(dá)產(chǎn)物的正確性等。相對(duì)于其他檢測(cè)蛋白的方法而言Western Blot實(shí)驗(yàn)在蛋白的定性定量分析、與目的蛋白量的比較方面更簡(jiǎn)單一些。
雖然,順利的時(shí)候Western blot做起來(lái)很簡(jiǎn)單,可不順的時(shí)候也很令人心煩――做不出結(jié)果啦、假陽(yáng)性啦、結(jié)果出現(xiàn)多條帶啦、抗體問(wèn)題啦(一抗有問(wèn)題還是二抗有問(wèn)題啦)……畢竟,作為一種有活性的生物大分子,抗體和抗原的反應(yīng)不象1+1那么明確,而用這種不確定的試劑來(lái)測(cè)定同樣知之甚少的表達(dá)產(chǎn)物,確實(shí)是有一定的不確定性的。所以,嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?Western Blot實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中要求有良好的參照體系,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析是非常有用。特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問(wèn)題時(shí),借助參照體系很容易就可以查出問(wèn)題所在,而不必抓耳撓腮怨天尤人。
良好的參照體系通常包括分子量marker(用來(lái)確定蛋白條帶對(duì)應(yīng)的分子量大小)、空白載體對(duì)照 (如果是誘導(dǎo)表達(dá)體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對(duì)照)、已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對(duì)照,另外還有內(nèi)參。內(nèi)參即是內(nèi)部參照 (Internal Control),對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白 (Housekeeping Proteins),它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。在Western Blotting 實(shí)驗(yàn)中,除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外,還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測(cè),以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差,保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
實(shí)際上內(nèi)參是最容易被忽略的一項(xiàng)。我們知道,要用Western Blot 比較不同條件下或者不同組織中,目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少,前提條件是等量的細(xì)胞上樣,才有比較的基礎(chǔ),特別表達(dá)量不高時(shí),上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析,所以需要內(nèi)參。在國(guó)外發(fā)表的文章中,Western Blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果須進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是,國(guó)內(nèi)仍有不少科研人員在Western Blotting實(shí)驗(yàn)中忽略了內(nèi)參的使用,將蛋白濃度測(cè)定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。
然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法,都存在局限性,不能完全準(zhǔn)確的確定各種樣品的蛋白濃度。如UV法直接定量,適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì),相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō),操作簡(jiǎn)單,但是容易受到平行物質(zhì)如DNA的干擾,且敏感度低,要求蛋白的濃度較高。比色法測(cè)定蛋白濃度一般有BCA、Bradford、 Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford法敏感度最高,且與一系列干擾Lowry、BCA 反應(yīng)的還原劑 (如DTT,巰基乙醇) 相容,但是對(duì)去污劑依然是敏感的,其最主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,無(wú)可比性。另外,蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時(shí)需要等量上樣,此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參,即可簡(jiǎn)便地對(duì)定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。
在Western Blotting中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過(guò)程中另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參,這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá),由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差,這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照,檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
在Western Blotting實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用內(nèi)參的方法通常有以下三種。
第一種是超級(jí)簡(jiǎn)便的標(biāo)記內(nèi)參使用法,只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體,按照正常操作即可。
第二種是普通內(nèi)參,當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí),可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè),然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體,重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測(cè)。
第三種,當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下,可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染,根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠,使?nèi)參蛋白與目的蛋白分開(kāi),然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育,二抗溫育以及顯色。
常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我們選擇內(nèi)參與要檢測(cè)的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你檢測(cè)的蛋白的分子量來(lái)選擇合適的內(nèi)參!
actin即肌動(dòng)蛋白,是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。actin大致可分為六種,其中四種是不同肌肉組織特異性的,包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin,其余兩種廣泛分布于各種組織中,包括beta-actin (β- non-muscle)和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的,在肌肉組織中的beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來(lái)就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參,不能一概而論的。beta-actin作為內(nèi)參是得到了公認(rèn)的,這是針對(duì)大多數(shù)組織和細(xì)胞來(lái)說(shuō)的,它廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi),表達(dá)量非常豐富。GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶) 是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶,而tubulin和actin類似,是細(xì)胞骨架的組成部分,但是不是肌肉的主要成分,應(yīng)該是一個(gè)代替品。三種同時(shí)發(fā)生變化的情況很少,需要具體分析。一旦出現(xiàn)上述三種內(nèi)參同時(shí)發(fā)生變化,如果是總蛋白可以用胞核的內(nèi)參如PCNA,TATA-box bingding protein (TBP) 甚至線粒體的內(nèi)參來(lái)代替,當(dāng)然一般這種可能性出現(xiàn)的幾率微乎其微。
不同異構(gòu)體表達(dá)對(duì)蛋白的檢測(cè)是有很大的影響,買抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白,很多抗體雜不出條帶其實(shí)未必是抗體質(zhì)量的問(wèn)題。很多公司的內(nèi)參抗體是用抗原片段制備的,不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的beta-actin為例,有的公司選擇N-端,有的選擇C-端。選用N- 端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作為抗原制備抗體(單抗和多抗)的占大多數(shù),這類抗體均不能檢測(cè)心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體的主要有 Axxora PLATFORM (PSC-3777),EPITOMICS (1784-1,1854-1等),這類抗體可以在肌肉細(xì)胞中檢測(cè)到actin陽(yáng)性信號(hào)。有時(shí)候在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)內(nèi)參時(shí)產(chǎn)生“組織特異性”,就是由于抗體選擇不對(duì)造成的。
actin幾種異構(gòu)體存在組織分布特異性,不同型actin之間具有較高的序列相似性(>90%)。β-actin是分布于非肌細(xì)胞中的一種骨架蛋白,選擇作β-actin內(nèi)參時(shí)首先得保證是組織廣泛表達(dá)的(尤其是做蛋白的組織表達(dá)譜時(shí))。那么制備β-actin抗體的抗原應(yīng)該是選用與actin其它異構(gòu)體一致的氨基酸序列。公司制備抗體是選用beta-actin的某一段小短肽作為免疫原,可能會(huì)因?yàn)檫x取的短肽在不同型actin之間保守與否,而導(dǎo)致所制備抗體具有一定的組織特異性.如選取的短肽僅在beta型存在,所得抗體就僅能檢測(cè)非肌細(xì)胞中的actin,而選取的短肽在六型中均存在,則此抗體除非肌細(xì)胞外,還可以檢測(cè)cardiac,skeletal,smooth muscle細(xì)胞的actin。
Western Blot實(shí)驗(yàn)中選擇內(nèi)參作為參照體系對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析具有很好的說(shuō)明性。內(nèi)參的選擇往往使用一些常見(jiàn)的管家基因,常用蛋白內(nèi)參有GAPDH、beta-actin等。Western Blot實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參的選擇及其使用方法都會(huì)直接影響對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。
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