蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）的設計/工作原理

蒸發(fā)光散射檢測是目前中藥材檢測中常用的分析儀器，它是2015版藥典標準黃芪甲苷檢測必不可少的儀器之一。

蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）工作原理

一、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD)的設計原理：

在輔助氣體作用下，將流動相霧化，形成的液霧（霧珠）通過加熱而蒸發(fā)，此時溶解在流動相中不易揮發(fā)的樣品即形成顆粒物，這些顆粒物由輔助氣體推動進入光束通道，造成光束散射。通過測定散射光的強度即可預測樣品顆粒的數(shù)量，從而測定樣品濃度。

二、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD)基本結構：

依據(jù)ELSD的設計原理，ELSD的結構由三大部分組成：即霧化霧珠處理，蒸發(fā)和散射光檢測。 第一步：霧化過程，也稱為噴霧過程。流動相與輔助氣混合，在輔助氣的壓力作用下從一小孔中噴出而形成濃霧，整個裝置稱為噴嘴或稱霧化器。流動相霧化后形成的液霧（霧珠）由于均勻性及一致性差，因此必須進行處理，否則影響某其有效蒸發(fā)。此過程稱為分流。依據(jù)不同的分流方式，ELSD經歷了三代發(fā)展。即限流器分流技術時代，撞擊器及低溫分流技術時代和熱分流技術時代。在第二代分流技術時代，依據(jù)所使用的分流技術不同，出現(xiàn)了兩大類的ELSD，即常說的A型和B型。A型ELSD以撞擊器分流技術設計，可以實現(xiàn)分流和不分流兩種操作模式；B型ELSD，以低溫分流技術設計，只能實現(xiàn)分流操作，但由于其霧珠處理利用顆粒粒度方式分流，因而實現(xiàn)了低溫揮發(fā)，特別有利于半揮性化合物的測定及高水相流動相的應用。

A、B類型其區(qū)別在于：類型A的操作是全部柱流出物都進入直的漂移管，讓流動相在其中蒸發(fā)；類型B的操作是把柱流出物通過一個彎管，在此管中大的顆粒沉積下來流入廢氣管，其余的小顆粒進入螺旋狀的蒸發(fā)管。Wilcox考察了這兩種類型的ELSD，他認為類型A的ELSD把所有的氣溶膠都送到漂移管中，為了有利于蒸發(fā)常常使用較高的操作溫度，因此它適合于檢測不揮發(fā)的樣品，使用流速為1.0ml/min（或更低流速）的揮發(fā)性流動相進行分析。類型B的ELSD將大顆粒氣溶膠撞在彎曲管管壁上除去，使氣溶膠粒度分布變窄，在較低的溫度下易于蒸發(fā)，適合于檢測半揮發(fā)性樣品，以流速為1.5ml/min（或更高流速）的高含水流動相進行分析。

第二步：蒸發(fā)，經過第一部處理的霧珠進一步流向經加熱處理的區(qū)域，此時霧珠在熱的作用下不斷揮發(fā)形成氣體，揮發(fā)性差的樣品從流動相霧珠中析出而形成顆粒物。這一裝置稱為蒸發(fā)區(qū)或漂移管。漂移管也有兩種設計方式，即螺線管式和直管式設計。螺線管有更長的漂移距離，能更好的實現(xiàn)蒸發(fā)，但隨著流動相所經距離的延長，峰形變寬，靈敏度降低，且漂移管不方便維護，而直管則有更窄的峰，相對靈敏度提高，且維護方便。

第三步：檢測，監(jiān)測區(qū)由光源和光檢測器組成，光源經光學處理后形成一束光，穿過漂移管末端口，氣體經過光束時，不會影響光的穿透，而當樣品顆粒經過時，光即產生散射。散射出來的光照在90度位置上的光檢測器即產生廣電信號。在這里，光源有激光器、LED和鎢鹵燈。

激光器：光源強度大，發(fā)熱少，結構簡單，無需特殊光學聚光文件。壽命長。
LED：發(fā)熱少，結構簡單，強度弱，須進行聚光等光學處理。
鎢鹵燈：發(fā)熱大，強度弱，須進行聚光等光學處理，波長范圍寬。
散射監(jiān)測器其實應與光源配合使用，對于激光器，由于光強度大，其散射光強度也強，常用光電二極管作為檢測器，而對于光強較弱的光源，必須使用光電倍增管作為檢測器。
光電二極管：結構簡單，體積小，無特殊供電路，故障率低。
光電倍增管：體積較大，需供高壓，故障率高，放大倍數(shù)可控制，可檢測低強度光。

三、 ELSD特征：

依據(jù)ELSD原理，ELSD是一類廣譜性、通用型質量檢測器，幾乎所有揮發(fā)性低的化合物均可被檢測，且ELSD是質量型檢測器，只與待測物的量有關，而與其光學特性，電化學特征及化合物本身的組成無關。

四、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD)的檢測原理

盡管ELSD有兩種檢測模式，但其檢測原理是相同的。Charlesworth奠定了ELSD檢測的理論基礎。Mengerink等系統(tǒng)地總結如下：

1）霧化   色譜柱流出進入霧化器后，與充入的氣體混合形成液滴，液滴的平均直徑D0可以用Nakiyama和Tanasawa提出的公式計算：
D0=0.585×Sqr(σ)/( Δμ*sqr(ρ))+212(η/σ*ρ)＾0.45*（(1000×FL/Fg)＾1.5）
其中D0為表面積體積平均直徑（μm），為洗脫液的表面張力（N/m）；Δμ為液體和氣體之間的線速差（μm/s）；η為柱流出物的粘度（Pa.s）；ρ為柱流出物的體積質量（Kg/m）；FL/Fg為柱流出物與氣體的流速比。最初的液滴直徑分布為高斯分布或非對稱的正態(tài)分布。

2）漂移 液滴進入漂移管后揮發(fā)。液滴進入到加熱的漂移管中，至少有三個現(xiàn)象發(fā)生：易揮發(fā)的部分蒸發(fā)；一些顆粒落到漂移管的管壁上；一些顆粒凝結在一起。Charlesworth提出了計算柱流出物蒸發(fā)時間的公式：
Td=ΔHVρD0＾2/MvKfΔT
其中td為完全揮發(fā)的時間；ΔHV/M為摩爾揮發(fā)度；ΔT為霧化氣體與液體表面的溫度差；Kf為液滴周圍氣體薄層的熱導率。
當溫度上升到一定程度，被分析物（a）會同流動相一道揮發(fā)，因此最佳溫度為tdm < td <tda。但為了減少顆粒在漂移管管壁上的沉淀，td的選擇最好是比tda略高一點。FL/Fg增大會使顆粒間更容易凝結。

3）在可以忽略漂移管管壁上的沉淀或平均直徑不被其它因素改變的前提下，進入光散射池的氣溶膠中的顆粒直徑d與被分析物在洗脫液中的濃度C成正比：
d∝ D0 （ c/ρa）＾（1/3）             (*)
其中：ρa為被分析物的體積質量。
對于軸心式的霧化器，當被分析物的質量濃度為1mg/L時，被分析物顆粒的大小處在米氏散射區(qū)域。根據(jù)米氏理論，散射光強度I可以表示為：
I=knd2（d/λ）＾y
其中：k為常數(shù)；n是散射區(qū)域中顆粒的數(shù)目；λ為檢測波長；隨著d/λ的增加，y值從4.0減小到-2.2。當λ和n為常數(shù)，散射光強度以d^p（p<6）指數(shù)增加，根據(jù)(*)式，散射光強度以c^q（q<2）指數(shù)增加。

根據(jù)大量實驗顯示，ELSD的相應值（Y）與被測物濃度（X）的關系曲線比較復雜。在較高濃度范圍內，大致呈線性；而在低濃度范圍內，則大致呈指數(shù)關系，即Y=Ax^b，其中的b值往往為1-2（與理論相符）；另有少數(shù)實驗表明，響應值與被測物濃度呈二次函數(shù)關系，即Y=aX+Bx^2。

⑷校正曲線和檢測限
當被分析物在洗脫液中的濃度較低時，被分析物濃度值的對數(shù)與響應值的對數(shù)的校正曲線大致呈線性。檢測限可以通過公式算出：
末找到
其中mLOD為檢測限（g）；m為注入的被分析物的質量（g）；N/H為噪音與峰高之比；x為校正曲線的斜率。
之后，Meeren等[建立了一個計算機模擬的ELSD檢測機理模型，其基本理論也是建立在米氏理論的基礎上。他們把影響ELSD的響應的因素分成四組：載氣氣壓，霧化器的設計，流動相的組成和流速都將影響到霧化過程；被分析物的濃度和密度等決定了進入光散射池的氣溶膠中的顆粒的直徑；被分析物的折射指數(shù)，光源發(fā)出的光的強度和波長，光電倍增管的位置等將影響到散射光強度；光電倍增管的靈敏度和入射光的強度決定了檢測的效率，即反映為實驗者所觀測到的峰面積。

馮埃生等 和Trathnigg等考察了影響ELSD檢測性能的基本因素，他們發(fā)現(xiàn)漂移管溫度對基線水平和噪音的影響沒有明顯的規(guī)律性，溫度過低流動相得不到充分揮發(fā)，使基線水平較高；溫度過高則可能帶來更大的噪音。氣體流速增大，使響應值減小，故最佳氣速是在可接受噪音的基礎上，產生最大檢測響應值的最低氣體。流動相中可以加入低于10mmol/L的揮發(fā)鹽來調節(jié)所需的酸度。他們在實驗中也發(fā)現(xiàn)，峰面積和峰高的自然對數(shù)分別與濃度的自然對數(shù)有較好的線性關系。

此外，還有不少實驗者在用ELSD檢測各種物質時，不同程度地研究了影響ELSD檢測性能的基本因素，但其研究都不夠系統(tǒng)，而且沒有提出相應的理論。

4. ELSD在HPLC中的應用研究
ELSD在對類酯、表面活性劑、糖、氨基酸、 季銨鹽、高聚物、甾體化合物等物質的檢測，以及藥物分析方面發(fā)揮著重要的作用。

歸納起來，這些物質往往具有如下的特點：1.物質本身不含生色團或吸光系數(shù)不大，使用UVD檢測靈敏度很低。2.物質組分復雜，組分間極性差異較大，分離需要進行梯度洗脫，故RID幾乎不適用，短波長UVD在梯度洗脫時常會發(fā)生基線漂移。使用ELSD檢測，可以克服這些困難。對于不含生色團的物質，ELSD可以不經衍生，直接進行檢測，從而避免了衍生帶來的誤差；ELSD在檢測過程中，將流動相完全揮發(fā)，因此在梯度洗脫時，基線平穩(wěn)。對不同物質，ELSD響應因子的變化比其他檢測器（如紫外檢測器）要小得多，在因缺乏標準品而無法做校正曲線的情況下，利用ELSD可以近似地提供不純物的定量測定。HPLC/ELSD的色譜條件與LC/MS是一致的，在脫機情況下，使用HPLC/ELSD可以為LC/MS摸索色譜條件，節(jié)省使用昂貴的LC/MS系統(tǒng)的操作成本，而且可以方便地用LC/MS來分析檢測出的不純物，進行結構判定。

五、流動相為1ml/min時，霧化器氮氣流量和漂移管溫度與流動相組成的關系。
單一流動相 霧化器氮氣流量 漂移管溫度
環(huán)己烷 1.70 SLPM 70 ℃

氯 仿 1.65 SLPM 70 ℃

甲 醇 1.65 SLPM 70 ℃

乙 腈 1.70 SLPM 70 ℃

水 3.20 SLPM 115℃

混合流動相: 按流動相中混合溶劑的比率、計算混合流動相所需的霧化器氣體流量和漂移管溫度。例如以60%甲醇/水為流動相，其漂移管氣體流量=(0.60)(1.65)+(0.40)(3.20)=2.27 SLPM; 其漂移管溫度=(0.60)(70)+(0.40)(115)=88 ℃

梯度分離: 當進行梯度分離時，根據(jù)流動相中最低揮發(fā)性的溶劑決定霧化器氣體流量和漂移管溫度。

注：提高流動相流速，則應相應提高霧化器氮氣流量和漂移管溫度；降低流動相流速，則應相應降低霧化器氮氣流量和漂移管溫度。

3. ALLTECH  500ELSD 分析標準流動相流速為1ml/min，若要使用大于或小于1ml/min的流速，則應參考500ELSD說明書優(yōu)化霧化器氮氣流量及漂移管溫度。

4. 每次使用完畢，應及時倒空500ELSD冷肼中冷凝的廢液，若冷肼中廢液積滿，會影響尾氣排放，造成基線噪音增加。

六. 結論

在以上的研究中，實驗者都要對ELSD進行條件優(yōu)化，即通過調節(jié)載氣流速和漂移管的溫度，使信噪比達到最大。
蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD)的響應不依賴于物質的光學性質，能檢測揮發(fā)性低于流動相的樣品。其檢測靈敏度高，檢測限已可達ng級；檢測過程中，其基線穩(wěn)定，能進行梯度洗脫。理論表明，ELSD的響應與被分析物的理化性質有一定關系，但這種關系并不大，某些實驗也證明了這一點，從這個意義上來講，ELSD不能被稱為真正的質量檢測器；由于被測物往往為同一類物質，其性質比較類似，因此許多實驗者報道響應不依賴于被分析物的理化性質，理論與實際并不矛盾。